20(S)-人參皂苷Rg3體外對多發(fā)性骨髓瘤U266細(xì)胞系的增殖抑制作用

侯俊杰 宋艷秋 黃式敏 康麗花 (吉林省人民醫(yī)院腫瘤生物治療中心，吉林 長春 300)

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種起源于B細(xì)胞系的惡性腫瘤，其特征為合成和分泌大量結(jié)構(gòu)均一的單克隆Ig或其輕鏈(也可不分泌)，引起骨折、貧血、出血、腎功能損傷、反復(fù)感染及Ig異常等一系列臨床表現(xiàn)〔1〕。目前新藥的單用或新老藥物的聯(lián)合使用以及造血干細(xì)胞移植等方法，提高了患者的緩解率及延長了總生存期，亦明確改善了預(yù)后，但仍不能完全治愈本病，新藥的開發(fā)仍然是目前面臨的課題〔2〕。20(S)-人參皂苷Rg3屬原人參二醇型皂苷，在實體瘤中已經(jīng)被證明具有顯著抗腫瘤效應(yīng)〔3〕，可抑制腫瘤細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的浸潤、黏附，抑制腫瘤新生血管的形成等多種途徑抑制腫瘤生長，對惡性血液病的作用及機(jī)制至今鮮有報道，更未見用于MM治療的研究報道。根據(jù)20(S)-人參皂苷Rg3在實體瘤中的抗腫瘤機(jī)制，有將其應(yīng)用于MM治療的可能。本實驗以MM U266細(xì)胞系為研究對象，觀察20(S)-人參皂苷 Rg3對U266細(xì)胞系增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期的影響，并探討可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 MM U266細(xì)胞系為本實驗室凍存，為懸浮生長的細(xì)胞株。20(S)-人參皂苷Rg3針劑(10 mg/ml)由吉林大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)教研室提供;RPMI-1640培養(yǎng)液為Gibco公司產(chǎn)品;胎牛血清(FSC)為HyClone公司產(chǎn)品;四甲基偶氮唑鹽(MTT)為北京鼎國公司產(chǎn)品;Annexin-V/PI細(xì)胞凋亡試劑盒及碘化丙啶(PI)單染細(xì)胞周期檢測試劑盒為寶泰克公司產(chǎn)品;βactin多克隆抗體(小鼠抗人)、半胱氨酸蛋白酶(caspase-3)抗體(小鼠抗人)、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗小鼠IgG為碧云天生物技術(shù)公司產(chǎn)品;RNA酶、四甲乙酸二胺(TEMED)、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜均購鼎國公司;蛋白分子量marker購于寶泰克公司;Protease inhibitor Cocktail tablets購于羅氏公司，定影液、顯影液及膠片為柯達(dá)產(chǎn)品;流式細(xì)胞儀美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) U266細(xì)胞株懸浮培養(yǎng)于含10%的滅活FSC RPMI-1640培養(yǎng)液(內(nèi)含2 mmol/L谷氨酰胺)中，置于5%CO2飽和濕度的37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。48～72 h傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞增殖情況 收集對數(shù)生長期的U266細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，分于 96孔板，每孔 100 μl，4×105個/孔。分為24 h，48 h 2個時間點。各個時間點分為溶質(zhì)對照組，細(xì)胞不加藥組(加入含相應(yīng)濃度丙二醇的10%胎牛血清1640培養(yǎng)液)，細(xì)胞+20(S)-人參皂苷 Rg3組(人參皂苷Rg3 終濃度分別為 5、10、20、40、80、160、320、640 μmol/L)。每組設(shè)5復(fù)孔。用藥時間終止后，每空加入20 μl MTT，5%CO2飽和濕度的37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h。反應(yīng)4 h后“新三聯(lián)”(10%SDS 10 g+5%異丁醇5 ml+10 mol/L HCl 0.1 ml)100 μl，反應(yīng)過夜。次日，用紫外分光光度儀測在570 nm處測各孔吸光度A值。按公式計算增殖抑制率。運用IC50計算軟件，分別計算出24 h、48 h的IC50值。該實驗重復(fù)3遍，結(jié)果取平均值。

1.2.3 流式細(xì)胞儀Annexin V/PI染色法檢測細(xì)胞凋亡情況 收集對數(shù)生長期的U266細(xì)胞，配成1×106個/ml的細(xì)胞懸液，接種于6孔板中，每孔2 ml，每組3復(fù)孔，分別加入不同濃度20(S)-人參皂苷 Rg3，終濃度分別為 20、40、80 μmol/L 及空白組細(xì)胞，培養(yǎng)24 h時收集各組細(xì)胞。按照Annexin V/PI試劑盒說明書，經(jīng)流式細(xì)胞儀(FACS)檢測，Cell Quest軟件分析。

1.2.4 流式細(xì)胞儀PI單染色法檢測細(xì)胞周期情況 收集對數(shù)生長期的細(xì)胞，配成1×106個/ml的細(xì)胞懸液，接種于6孔板中，每孔2 ml，每組3復(fù)孔，分別加入不同濃度20(S)-人參皂苷 Rg3，終濃度分別為 20、40、80 μmol/L 及空白組細(xì)胞，培養(yǎng)24 h時收集各組細(xì)胞。按照PI單染說明書，反應(yīng)結(jié)束后24 h內(nèi)經(jīng)流式細(xì)胞儀(FACS)檢測，Cell Quest軟件分析。

1.2.5 20(S)-人參皂苷 Rg3作用24 h后活化的 caspase-3(cleaved caspase-3)蛋白表達(dá)的檢測 U266細(xì)胞于含10%滅活FSC的1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h，依據(jù)加入20(S)-人參皂苷Rg3濃度分為五組:既空白不加藥組和20(S)-人參皂苷Rg3終濃度分別為20、40、80、160 μmol/L 組。24 h 后收集細(xì)胞，4℃預(yù)冷的PBS洗滌 2次，加入細(xì)胞蛋白提取液，冰浴 10～30 min，12 000 r/min，4℃低溫離心5 min。取上清，經(jīng)Bradford分析方法定量。細(xì)胞蛋白提取液樣品(約50 μg)溶于樣品緩沖液中，混勻，沸水中熱溶5 min。取細(xì)胞總蛋白抽提液，以10% 的聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，用 caspase-3抗體(1∶1 000～2 000)4℃孵育過夜，再與 HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(1∶10 000)反應(yīng)后，X線底片曝光顯影。結(jié)果用圖像處理儀進(jìn)行灰度掃描分析，并以β-actin作為內(nèi)參照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以±s表示，采用獨立樣本t檢驗分析。

2 結(jié)果

2.1 20(S)-人參皂苷Rg3對MM U266細(xì)胞系的增殖抑制作用 20(S)-Rg3對U266細(xì)胞抑制率曲線及24、48 h的IC50值，分別為(71.07±2.63)μmol/L、(44.06±3.98)μmol/L。觀察到20(S)-人參皂苷Rg3對U266細(xì)胞系的增殖抑制在一定濃度范圍內(nèi)呈時間劑量依賴性，時間越長，劑量越大，抑制率越高，24、48 h處理組在320 μmol/L時出現(xiàn)抑制平臺期。見表1。

表1 不同濃度不同時間20(S)-Rg3對U266細(xì)胞吸光度及抑制作用( ± s，n=5)

表1 不同濃度不同時間20(S)-Rg3對U266細(xì)胞吸光度及抑制作用( ± s，n=5)

與空白組比較:1)P＜0.01，2)P＜0.05;與上一濃度組比較:3)P＜0.01，4)P＜0.05

濃度(μmol/L)24 h A值 抑制率(%)48 h(μmol/L)A值 抑制率(%)空白組0.810±0.009 － 0.899±0.022 －5 0.655±0.0281)19.18±4.911)0.707±0.0252) 21.39±2.75 10 0.652±0.0201)19.47±3.181)0.702±0.0482)21.94±5.401)20 0.597±0.0311)26.67±3.881)0.571±0.0341)4)36.43±3.741)4)40 0.495±0.0251)4)38.89±3.091)4)0.457±0.0461)4)49.18±5.131)4)80 0.382±0.0401)4)52.96±4.881)4)0.342±0.0301)4)61.99±3.291)4)160 0.259±0.0301)4)67.90±3.711)4)0.248±0.0121)3)72.47±1.311)3)320 0.207±0.0231)74.45±2.831)0.162±0.0091)3)81.95±0.941)3)640 0.154±0.0211)4)80.99±2.641)0.164±0.0111)81.73±1.221)

2.2 流式細(xì)胞儀PI法檢測20(S)-人參皂苷Rg3作用24 h后細(xì)胞周期變化 隨著20(S)-人參皂苷Rg3濃度的增加，G1期細(xì)胞數(shù)逐漸增多，同時S期百分比逐漸減少，而G2/M期百分比沒有明顯的變化;提示20(S)-人參皂苷Rg3對U266細(xì)胞阻滯在G1期。見表2。

表2 20(S)-人參皂苷Rg3作用24 h后對U266細(xì)胞周期的影響(±s，n=4，%)

表2 20(S)-人參皂苷Rg3作用24 h后對U266細(xì)胞周期的影響(±s，n=4，%)

與空白組比較:1)P＜0.01，2)P＜0.05;下表同

20(S)-Rg3(μmol/L)G0/G1 S G2/M空白組49.11±1.71 31.68±2.42 15.63±3.84 20 57.52±7.75 26.29±1.25 16.07±3.64 40 60.29±5.76 24.95±8.39 14.76±2.62 80 61.81±3.461) 21.52±4.202)16.67±3.03

2.3 人參皂苷對細(xì)胞凋亡的影響 選取終濃度為20、40、80 μmol/L 20(S)-人參皂苷Rg3作用于U266細(xì)胞24 h，早期凋亡率在藥物濃度為20～80 μmol/L之間時，隨藥物濃度升高而增加，在80 μmol/L時達(dá)到最高為(P＜0.01)，總凋亡率(為早期凋亡和晚期凋亡總和)與對照組比較，在藥物濃度為20～80 μmol/L之間時，隨藥物濃度升高而增加，有顯著差異(P＜0.01)。這說明人參皂苷Rg3可誘導(dǎo)U266細(xì)胞凋亡，并呈藥物濃度依賴性。見表3。

表3 20(S)-人參皂苷Rg3作用24 h后U266細(xì)胞早期凋亡率和總凋亡率的影響(±s，n=4，%)

表3 20(S)-人參皂苷Rg3作用24 h后U266細(xì)胞早期凋亡率和總凋亡率的影響(±s，n=4，%)

濃度(μmol/L)早期凋亡率 總凋亡率空白組0.51±0.05 1.27±0.29 20 8.32±0.831) 16.78±2.491)40 10.72±1.291) 22.44±1.381)80 15.27±2.261) 25.01±2.521)

2.4 20(S)-人參皂苷Rg3對凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對照空白組(0.18 ±0.02)比較，20、40、80、160 μmol/L 20(S)-人參皂苷Rg3處理U266細(xì)胞24 h后，隨著藥物濃度的增加，cleaved caspase-3表達(dá)上升(0.19±0.01，0.22±0.03，0.33±0.03，0.42 ±0.01，P ＜0.01)。

3 討論

細(xì)胞凋亡是抗腫瘤藥物抑制腫瘤細(xì)胞增殖的重要機(jī)制之一，本實驗說明20(S)-人參皂苷Rg3可誘導(dǎo)U266細(xì)胞凋亡，并呈藥物濃度依賴性，是其抑制MM細(xì)胞增殖的機(jī)制之一。

天冬氨酸特異性caspase家族是一組細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的蛋白裂解酶，被認(rèn)為是凋亡中最重要的影響因素之一〔4〕。研究發(fā)現(xiàn)Caspase-3是內(nèi)、外源性凋亡通路的匯聚點，它的活化標(biāo)志凋亡進(jìn)入不可逆階段〔5〕。

本文說明在20(S)-人參皂苷Rg3在誘導(dǎo)的U266細(xì)胞凋亡中，可能通過死亡受體途徑和或線粒體途徑誘導(dǎo)MM細(xì)胞凋亡的，確切的相互機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

細(xì)胞周期的改變與細(xì)胞凋亡的關(guān)系越來越引起人們的重視，細(xì)胞周期的阻滯也作為腫瘤治療的一個新靶點。在細(xì)胞分裂增殖過程中，G1/S作為細(xì)胞周期最重要的調(diào)控點，受諸多周期相關(guān)調(diào)控因子的調(diào)控，若在G1/S點出現(xiàn)調(diào)控異常:即正性調(diào)控因子功能增加或負(fù)性調(diào)控因子功能減弱或喪失，則可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和發(fā)展〔6〕。另外，G1/S調(diào)控點也是DNA損傷修復(fù)的關(guān)鍵點，DNA或在此時被修復(fù)而得以生存，或在此時無法有效修復(fù)而啟動細(xì)胞凋亡程序〔7，8〕，因此該調(diào)控點也成為了腫瘤治療的靶點。本實驗結(jié)果表明骨髓瘤U266細(xì)胞在20(S)-人參皂苷Rg3的作用下，可能改變了細(xì)胞周期的分布，使多數(shù)細(xì)胞發(fā)生了G0/G1期周期阻滯，阻止細(xì)胞向S期轉(zhuǎn)化，從而減少了DNA合成和有絲分裂，從而有效抑制骨髓瘤細(xì)胞生長，因此可以推測，20(S)-人參皂苷Rg3對細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)也是其MM細(xì)胞增殖和發(fā)展的重要干預(yù)環(huán)節(jié)之一。

目前，MM的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)有所增加，老年患者居多，暫時對其難以治愈。當(dāng)前新藥的單用或新老藥物的聯(lián)合使用以及造血干細(xì)胞移植等方法，在療效方面有所提高，但在不良反應(yīng)及復(fù)發(fā)耐藥等方面并不樂觀〔9〕。人參皂苷Rg3經(jīng)過30多年的研究，被證實其能抑制腫瘤細(xì)胞增殖并促其凋亡，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，逆轉(zhuǎn)細(xì)胞耐藥，抑制腫瘤新生血管的形成，提高患者免疫力，增敏化療〔10〕及減輕化療不良反應(yīng)等，具有廣泛抗瘤活性，且取材相對容易，價格低廉，尤其是20(S)-人參皂苷Rg3單體，又具備了生物利用度高，耐受性良好等優(yōu)點，更適合于臨床抗腫瘤的應(yīng)用。所以，根據(jù)MM發(fā)病機(jī)制及抗骨髓瘤U266細(xì)胞的效應(yīng)機(jī)制而言，該藥有可能被篩選出作為多發(fā)性骨髓瘤的潛在臨床治療藥物。

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