反復(fù)紫外線照射建立皮膚光老化模型

石 瀟 陳 煒 (江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院上海市第八人民醫(yī)院，上海 200235)

光老化指由紫外線日積月累的照射引起的皮膚老化，表現(xiàn)為皮膚暴露部位粗糙、皺紋加深加粗、結(jié)構(gòu)異常、不規(guī)則性色素沉著、血管擴(kuò)張、表皮角化不良、出現(xiàn)異常增殖、真皮彈性纖維變性及降解產(chǎn)物蓄積等〔1，2〕。而皮膚光老化可以并發(fā)和誘發(fā)多種皮膚病變，并與一些皮膚惡性腫瘤有著密切關(guān)系。此外，光老化導(dǎo)致皮膚過早皺縮粗糙、毛細(xì)血管擴(kuò)張、色素斑形成等，嚴(yán)重影響外表的美觀甚至人的心理。目前，皮膚光老化已經(jīng)作為一個(gè)獨(dú)立的疾病或者綜合征成為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)，因此建立光老化動(dòng)物模型對(duì)研究光老化的機(jī)制、預(yù)防、治療皮膚光老化有重要的意義，并且已經(jīng)有了各種相關(guān)的報(bào)道〔3，4〕。由于可以省去反復(fù)脫毛的繁瑣過程以及脫毛對(duì)皮膚的刺激和損傷，因此目前國外主要以裸鼠和無毛豚鼠作為模型動(dòng)物〔5，6〕，而紫外線照射建立的光老化裸鼠，其皮膚結(jié)構(gòu)改變更接近于人的皮膚光老化改變。本文綜合考慮國內(nèi)外建立模型的優(yōu)勢(shì)和問題，旨在建立裸鼠局部皮膚光老化模型，為皮膚光老化研究提供更好的動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 藥品與儀器 手持式紫外線燈(美國路陽儀器LEB-280 L，2根8 w UVB燈，峰值308 nm);小鼠超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒，小鼠羥脯氨酸(Hyp)試劑盒，小鼠丙二醛(MDA)試劑盒(上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司);普通光學(xué)顯微鏡 Olympus顯微鏡(日本)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/c雌性裸鼠15只，6周齡，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。日光燈模擬自然環(huán)境(晝夜交替12 h)飼養(yǎng)，常規(guī)飼食和飲水，無不良因素影響，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境后開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組 將15只雌性裸鼠隨機(jī)分成A、B、C 3組，每組5只。在裸鼠6周齡時(shí)用10%水合氯醛(0.2 ml/100 g)麻醉，于其右側(cè)背部用墨汁皮內(nèi)標(biāo)記出2.5 cm×1.5 cm大小的位置，作為紫外燈照射區(qū)域;左側(cè)相對(duì)區(qū)域皮膚不照射紫外線，為對(duì)照組。A組照射時(shí)間為6 w，B組照射時(shí)間為8 w，C組照射時(shí)間為10 w，并進(jìn)一步分為6 w實(shí)驗(yàn)組A1和6 w對(duì)照組A2、8 w實(shí)驗(yàn)組B1和8 w對(duì)照組B2以及10 w實(shí)驗(yàn)組C1和10 w對(duì)照組C2。

1.3.2 照射方法及處理 將適應(yīng)性飼養(yǎng)后的7周齡裸鼠固定，充分暴露出標(biāo)記區(qū)域，用厚紗布遮蓋未標(biāo)記區(qū)域皮膚，防止紫外線照射。將紫外燈垂直置于暴露的標(biāo)記區(qū)域皮膚上方6 cm處，按Moloney〔7〕實(shí)驗(yàn)所述方法，第1周每次給予裸鼠紫外線照射量為180 mJ/cm2(180 mJ/cm2為最小致紅斑量)，第2～4周間能量較前1 w 增加1/3，分別為240、300、360 MJ/cm2，此后第5周起維持360 mJ/cm2至各組照射實(shí)驗(yàn)結(jié)束。此后，A組、B組、C組在各自完成最后一次照射24 h后，斷頸處死裸鼠，并立刻取下紫外線照射區(qū)域皮膚和對(duì)側(cè)等大未照射皮膚。

1.3.3 HE染色 將所取皮膚固定48 h后，取出、脫水，于石蠟包埋，切片后，進(jìn)行HE常規(guī)染色。

1.3.4 SOD、Hyp、MDA檢測(cè) 取下裸鼠皮膚后立即進(jìn)行組織勻漿，取上清液，采用ELISA方法測(cè)定SOD、Hyp、MDA。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用±s表示，采用單獨(dú)樣本t檢驗(yàn)處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠照射6 w的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 HE染色 HE染色顯示6 w實(shí)驗(yàn)組A1與6 w對(duì)照組A2未見明顯差別，表皮細(xì)胞排列整齊，表皮、真皮分界清楚，真皮層可見波浪狀纖維組織，有序排列，均勻分布。見圖1。

圖1 兩組大鼠照射6 w皮膚組織學(xué)改變(HE)

2.1.2 ELISA檢測(cè) SOD、MDA、Hyp結(jié)果 6 w實(shí)驗(yàn)組 A1與6 w對(duì)照組A2大鼠血清SOD差異(P＜0.05)，MDA、Hyp未見明顯差異(P＞0.05)。見表1。

表1 照射6 w SOD、MDA、Hyp的變化( ± s，n=5)

表1 照射6 w SOD、MDA、Hyp的變化( ± s，n=5)

與A1組比較:P＜0.05

組別SOD Hyp MDA 6 w實(shí)驗(yàn)組A1 72.73±3.55 21.40±2.08 6.39±0.24 6 w對(duì)照組A2 88.73±7.451)17.87±2.91 5.65±1.07

2.2 裸鼠照射8 w的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 HE染色 HE染色顯示8 w實(shí)驗(yàn)組B1表皮較8 w對(duì)照組B2組稍增厚，分層部分不清，真皮組織排列較亂，分布不均，有少量炎性細(xì)胞浸潤。見圖2。

圖2 兩組大鼠照射8 w皮膚組織學(xué)改變(HE)

2.2.2 ELISA檢測(cè) SOD、MDA、Hyp結(jié)果 8 w實(shí)驗(yàn)組 B1與8 w對(duì)照組B2 SOD、Hyp差異顯著(P＜0.05)，MDA未見明顯差異(P＞0.05)。見表2。

表2 照射8 w SOD、MDA、Hyp的變化( ± s，n=5)

表2 照射8 w SOD、MDA、Hyp的變化( ± s，n=5)

與B1組比較:1)P＜0.05

組別SOD Hyp MDA 8 w實(shí)驗(yàn)組B1 90.03±10.91 25.12±3.51 8.46±1.33 8 w對(duì)照組B2 107.95±13.361)35.26±8.051)7.51±2.15

2.3 裸鼠照射10 w的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 HE染色 HE染色10 w實(shí)驗(yàn)組C1棘層增厚明顯，表皮結(jié)構(gòu)不完整，層次不清晰，真皮層疏松，真皮纖維因發(fā)生變性、破壞，真皮組織排列紊亂，炎性細(xì)胞浸潤。10 w對(duì)照組C2表皮細(xì)胞排列整齊，分界清楚，真皮層排列有序，分布均勻。見圖3。

圖3 兩組大鼠照射10 w皮膚組織病理學(xué)改變(HE)

2.3.2 照射10 w血清SOD、MDA、Hyp結(jié)果10 w實(shí)驗(yàn)組C1與10 w對(duì)照組C2 SOD、Hyp及MDA差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。見表3。

表3 照射10 w SOD、MDA、Hyp的變化(± s，n=5)

表3 照射10 w SOD、MDA、Hyp的變化(± s，n=5)

與C1組比較:1)P＜0.05

組別SOD Hyp MDA 10 w實(shí)驗(yàn)組C1 83.63±20.23 24.79±5.49 9.95±0.39 10 w對(duì)照組C2 115.57±11.491)33.49±4.211) 9.02±0.221)

3 討論

目前國內(nèi)外評(píng)價(jià)皮膚光老化的客觀標(biāo)準(zhǔn)主要是檢測(cè)衰老皮膚與正常皮膚中的與氧化相關(guān)物質(zhì)(包括測(cè)定SOD、谷胱甘肽、過氧化物酶和過氧化氫酶活性，谷胱甘肽含量和MDA水平)是否存在差異。此外，通過肉眼觀察到皮膚彈性減退、色素沉著增加以及皺紋形成的增多，并用組織切片觀察皮膚表皮層增厚，彈性纖維卷曲、變形，血管網(wǎng)排列紊亂、彎曲擴(kuò)張，皮脂腺不規(guī)則增生等描述性評(píng)價(jià)方法來鑒定皮膚是否光老化以及光老化的程度。

自20世紀(jì)80年代以來，很多國外研究者使用UV照射Skh-1裸鼠，成功的模擬出光老化皮膚的動(dòng)物模型〔7〕，并且發(fā)現(xiàn)Skh-1裸鼠經(jīng)UV照射后引起皮膚組織的改變非常類似于人類皮膚光老化的特性〔8～10〕。然而，由于Skh-1裸鼠價(jià)格昂貴等原因，國內(nèi)學(xué)者常常使用SD大鼠脫毛后，照射UV來建立皮膚光老化模型〔4，11〕。但是，利用SD大鼠建立皮膚光老化模型存在以下缺點(diǎn):①大鼠自然生長較快，隨著造模時(shí)間的延長，固定大鼠的難度會(huì)越來越大，給實(shí)驗(yàn)增加的難度;②造模過程中需要給大鼠反復(fù)脫毛，這不僅過程繁瑣，而且反復(fù)的脫毛會(huì)給皮膚帶來不同程度的刺激和損傷，影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果;③由于大鼠在自然環(huán)境中，皮膚不會(huì)直接受到紫外線照射，因此，紫外線照射脫毛大鼠所造成的皮膚光老化，與人的皮膚光老化相差較大，并不適合作為模擬人皮膚光老化的造模對(duì)象。④目前造模方法都是照射鼠的全部皮膚，這不利于在光老化研究中排出實(shí)驗(yàn)動(dòng)物間個(gè)體差異。

本文顯示局部皮膚反復(fù)紫外線照射10 w可以為研究皮膚光老化提供動(dòng)物模型，運(yùn)用此方法建立光老化動(dòng)物模型，不僅可以較好的模擬出皮膚光老化的特點(diǎn)，而且可以為國內(nèi)學(xué)者的研究提供方便，節(jié)省科研經(jīng)費(fèi)，同時(shí)提供較小的動(dòng)物個(gè)體間差異的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

但是，實(shí)驗(yàn)中也存在一些問題和缺陷需要進(jìn)一步去探究:①SOD指標(biāo)差異在照射6 w的裸鼠皮膚中就已經(jīng)出現(xiàn)，并且在照射8 w和10 w的裸鼠皮膚中都存在，是否說明SOD指標(biāo)較為敏感。②MDA指標(biāo)的改變出現(xiàn)最晚，只有在照射10 w的裸鼠皮膚中出現(xiàn)，是否可認(rèn)為MDA指標(biāo)的敏感性可能不如SOD，但其特異性較高。③膠原蛋白是結(jié)締組織的主要成分，而Hyp是膠原蛋白中主要并相對(duì)穩(wěn)定的氨基酸成分。膠原蛋白含量在年輕階段較高，而此后持續(xù)下降，在老年階段下降尤為明顯〔12〕。給予皮膚組織一定程度的刺激可以誘導(dǎo)膠原蛋白的增生，這可能與6 w實(shí)驗(yàn)組A1所測(cè)得Hyp含量高于6 w對(duì)照組A2有一定的關(guān)系。④由于裸鼠皮膚彈性較好，延展性較高，照射部位皮膚HE染色及相關(guān)生化指標(biāo)提示具有光老化特征，但肉眼觀察皮膚組織粗燥并不明顯，且未見顯著皺紋，因而導(dǎo)致此造模方法在某些需要通過肉眼觀察皮膚粗糙程度、皺紋深淺及結(jié)構(gòu)變化的實(shí)驗(yàn)中受到了限制。⑤雖然10 w實(shí)驗(yàn)組C1所制作的裸鼠光老化皮膚模型已經(jīng)與光老化皮膚接近，但相對(duì)于人的暴露于紫外線中所造成皮膚光老化的時(shí)間仍然顯得短暫，可以進(jìn)一步延長照射周數(shù)，以使得模型動(dòng)物更加完美。

1 Imayama S，Ueda S，Isoda M.Histologic Changes in the skin of hairless mice following peeling with salicvlic acid〔J〕.Arch Dermatol，2000;136(11):1390-5.

2 Gilchrest BA.A review of skin ageing and its medical therapy〔J〕.Br J Dermatol，1996;135(6):867-75.

3 劉 瑋.皮膚光老化〔J〕.臨床皮膚科雜志，2003;32(7):424-7.

4 郭魯義.實(shí)用光老化動(dòng)物模型建立方法的探討〔J〕.中國美容醫(yī)學(xué)，2008;2(17):235-7.

5 Harrison JA，Wallker SL，Plastow SR，et al.Sunscreens with low sun protection factor inhibit ultraviolet B and A photoaging in the skin of the hairless albino mouse〔J〕.Photodermatol Photoimmunol Photomed，1991;8(1):12-20.

6 Horio T，Miyauchi H，Asada Y.The hairless guinea pig as an experimental animal for photodermatology〔J〕.Photodermatol Photoimmunol Photomal，1991;8(1):69-72.

7 Moloney SJ.The hairless mouse model of photoaing:evaluation of the relationship between dermal elastin，collagen，skin thickness and wrinkles〔J〕.Photochemi Photobiol，1992;56(4):505-11.

8 Kligman LH.The hairless mouse model for photoaging〔J〕.Clin Dermatol，1996;14(2):183-95.

9 Hiroyuki Y，Hiromu S.Chemilumineseent detection and imaging of reactive oxygen species in live mouse skin exposed to UVA〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2000;269(1):131-6.

10 Svohodova A，Waherova D，Vostalova J.Ultraviolet light induced alteration tothe skin〔J〕.Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Oiomoue Czech Republ，2006;150(1):25-38.

11 張 璃.小白鼠皮膚光老化模型的建立〔J〕.廣東醫(yī)學(xué)，2005;26(12):1642-3.

12 Bjorksten J，Tenhn H.The crosslinking theory of aging-added evidence〔J〕.Exp Gerontol，1990;25(2):91-5.