甘肅產(chǎn)藏藥五脈綠絨蒿有效部位對肝纖維化大鼠抗氧化系統(tǒng)的影響

王志旺 王瑞瓊 郭 玫 邵 晶 任 遠(yuǎn) (甘肅中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，甘肅 蘭州 730000)

〔2012-06-20收稿 2012-09-10修回〕

綠絨蒿味甘、澀，性涼，具有清熱解毒、止痛利尿等功效，臨床用于治療頭痛、肝炎、肺炎、肝與肺的熱癥、水腫等病癥〔1〕，而藏醫(yī)藥以五脈綠絨蒿(MQR)為其正品，在30多個(gè)藏藥復(fù)方中配伍使用。前期研究顯示甘肅產(chǎn)藏藥MQR及其中總黃酮具有明顯的鎮(zhèn)痛抗炎〔2〕、體外抗氧化〔3〕等作用;本研究探討甘肅產(chǎn)藏藥MQR提高肝纖維化大鼠抗氧化系統(tǒng)水平以及保肝降酶等作用的有效部位及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 SPF級(jí)Wistar大鼠，體重180～220 g，雌雄兼用，由甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)SCXK(甘)2011-0001;SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，許可證號(hào)為SYXK(甘)2011-0001。甘肅產(chǎn)藏藥MQR醇提物、總黃酮及總生物堿提取物適量，置研缽中，加入適量吐溫-80，干膠法按“油∶膠∶水=2∶1∶2”的比例制備初乳，適當(dāng)稀釋即得甘肅產(chǎn)藏藥MQR醇提物、總黃酮與總生物堿混合物、總黃酮、總生物堿的乳劑;另取適量吐溫-80制備1.5%的溶液作為對照液，冷藏備用。秋水仙堿，西雙版納版納藥業(yè)責(zé)任有限公司生產(chǎn)，批號(hào):20110711。四氯化碳(CCl4)，廣東汕頭市西隴化工廠;丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)試劑盒均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。TGL-16G高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;722型分光光度計(jì)，上海第三分析儀器廠產(chǎn)品;BS1103型Sartorius電子分析天平，北京賽多利斯儀器有限公司;HH-S型恒溫水浴鍋，金壇市正基儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 甘肅產(chǎn)藏藥MQR各受試藥的制備 甘肅產(chǎn)藏藥MQR全草購自甘肅省合作市藏醫(yī)院，經(jīng)甘肅省定西市臨洮農(nóng)校盧通寧高級(jí)講師鑒定。稱取藥材粗粉適量，用90%乙醇回流提取2次，提取液減壓回收乙醇，并進(jìn)一步干燥得乙醇提取物干浸膏(醇提物)。將醇提物溶于適量蒸餾水中，用石油醚萃除脂溶性較強(qiáng)的雜質(zhì)，殘留物用1 mol/L HCl溶液溶解，調(diào)pH值至2～3，過濾，濾液中主要含有生物堿，殘留物即為黃酮類粗品。將上述黃酮粗品用1 mol/L NaOH溶液溶解，調(diào)pH值至9～10，過濾，堿水層再用1 mol/L HCl溶液調(diào)pH值至2～3，用乙酸乙酯萃取數(shù)次，合并乙酸乙酯，減壓濃縮即得MQR總黃酮。將上述含有生物堿的酸性濾液用濃氨水調(diào)pH值至9～10，用氯仿萃取數(shù)次，分離氯仿層，回收氯仿即得MQR總生物堿。將上述所得總黃酮與總生物堿按提取率混合即得甘肅產(chǎn)藏藥MQR總黃酮與總生物堿提取物(黃堿提取物)。

1.2.2 動(dòng)物分組、造模與給藥 取SPF級(jí)Wistar大鼠88只，自由飲食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，按體重、性別隨機(jī)分成8組，即正常對照組、模型組、秋水仙堿組(陽性對照組)、MQR醇提物組(醇提組)、MQR總黃酮+總生物堿組(黃堿組)、MQR總黃酮高劑量組(黃酮高劑量組)、MQR總黃酮低劑量組(黃酮低劑量組)以及MQR總生物堿組(生物堿組)各11只。參照張萬國等〔4〕CCl4復(fù)合因素復(fù)制大鼠肝纖維化造模:除正常對照組外，給大鼠皮下注射40%CC14橄欖油溶液，2次/w，首劑量為5.0 ml/kg，以后每次劑量3.0 ml/kg，持續(xù)6 w;造模第3、4 w 給予高脂、低蛋白質(zhì)復(fù)合飼料(玉米粉79.5%+膽固醇0.5%+豬油20%)，其余各周給予普通飼料;6 w造模期間用20%乙醇作為唯一飲料。正常對照組注射等量橄欖油，進(jìn)食普通飼料并自由飲水。各組大鼠從造模第1天起每天給予相應(yīng)藥物15 ml/kg，其中正常對照組與模型組給予對照液，1次/d，連續(xù)給藥6 w。

1.2.3 指標(biāo)觀測與方法實(shí)驗(yàn)開始時(shí)每組11只大鼠，實(shí)驗(yàn)期間模型組有1只大鼠體重迅速下降而死亡，陽性對照組與黃酮高劑量組各有1只大鼠因灌胃不當(dāng)而死亡，其余85只大鼠完成實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)第6周，大鼠末次給藥24 h，禁食12 h后，用2%戊巴比妥鈉麻醉，股靜脈采血，血液3 000 r/min離心10 min，分離血清，按試劑盒說明書檢測ALT與AST的水平。處死大鼠，摘取肝臟，觀察外形、色澤、質(zhì)地并留取肝臟標(biāo)本:在肝右葉固定位置取肝組織，用10%多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片、HE染色，做病理組織學(xué)觀察，并進(jìn)行半定量分析〔5〕;在肝左葉固定位置取肝組織，立刻用生理鹽水漂洗數(shù)次，濾紙拭干后，取適量置冰浴中的組織勻漿器內(nèi)，加入冰生理鹽水，制成100 g/L(10%)肝組織勻漿，在4℃下4 000 r/min離心，取上清液，檢測SOD與CAT的活性以及MDA的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)采用±s表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 甘肅產(chǎn)藏藥MQR對肝纖維化大鼠血清肝功能的影響與正常對照組比較，模型組ALT與AST顯著升高(P＜0.01);與模型對照組比較甘肅產(chǎn)藏藥MQR醇提物、黃堿組及總黃酮高、低劑量組大鼠血清ALT與AST明顯降低(P＜0.01)，且總黃酮的降低作用有一定的量效關(guān)系;同時(shí)發(fā)現(xiàn)生物堿的降酶作用不明顯(P＞0.05)。見表1。

表1 甘肅產(chǎn)藏藥MQR對肝纖維化大鼠血清肝功能的影響(±s)

表1 甘肅產(chǎn)藏藥MQR對肝纖維化大鼠血清肝功能的影響(±s)

與模型組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與黃酮低劑量組比較:3)P＜0.05，4)P ＜0.01;下表同

組別 n ALT(IU/L) AST(IU/L)正常對照組 11 45.21±6.202) 174.98±15.382)模型組 10 119.35±22.11 329.93±34.46陽性對照組 10 66.44±10.032) 210.99±20.802)醇提物組 11 71.40±11.392) 235.22±23.642)黃堿組 11 75.76±11.522) 242.18±25.952)黃酮高劑量組 10 78.65±12.802)3) 250.21±24.872)4)黃酮低劑量組 11 93.11±13.232) 291.35±26.972)生物堿組11 108.47±16.60 306.22±28.14

2.2 甘肅產(chǎn)藏藥MQR對肝纖維化大鼠肝組織脂質(zhì)過氧化的影響 CCl4復(fù)合因素在復(fù)制肝纖維化的過程中，引起大鼠肝組織SOD、CAT的活性明顯減低、MDA的含量顯著升高，與正常對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);甘肅產(chǎn)藏藥MQR醇提物、黃堿組、總黃酮高、低劑量組能明顯提高SOD與CAT的活性，降低氧化產(chǎn)物MDA的含量;同時(shí)，隨著劑量的加大，甘肅產(chǎn)藏藥MQR總黃酮的作用逐漸增強(qiáng)，顯示出明顯的量效關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，甘肅產(chǎn)藏藥MQR總生物堿的抗氧化作用不明顯(P＞0.05)。見表2。

表2 甘肅產(chǎn)藏藥MQR對肝纖維化大鼠肝組織脂質(zhì)過氧化的影響(±s)

表2 甘肅產(chǎn)藏藥MQR對肝纖維化大鼠肝組織脂質(zhì)過氧化的影響(±s)

組別SOD(U/mg)CAT(U/mg)MDA(mmol/mg)正常對照組 188.53±24.072) 25.23±2.802) 10.06±1.282)模型組 105.30±18.96 10.39±1.70 24.94±3.02陽性對照組 143.52±19.402) 16.30±1.942) 17.35±2.552)醇提物組 166.25±20.572) 21.59±2.632) 14.93±2.152)黃堿組 165.45±19.672) 21.07±1.992) 15.04±2.192)黃酮高劑量組167.59±21.122)4)22.34±2.652)4) 15.25±2.432)3)黃酮低劑量組 132.68±19.032) 15.45±1.912) 18.37±2.862)生物堿組 122.49±19.021)11.53±1.81 22.51±2.95

2.3 甘肅產(chǎn)藏藥MQR對肝纖維化大鼠肝組織病理變化的影響 隨著CC14注射次數(shù)的增加，造模大鼠逐漸出現(xiàn)弓背喜臥，委靡不振，毛發(fā)干枯，進(jìn)食差，其中模型組動(dòng)物的表現(xiàn)更為明顯。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物解剖后肝臟表面顏色、質(zhì)地有明顯的區(qū)別:空白對照組肝臟呈紫紅色，表面光滑勻質(zhì);模型組肝臟表面粗糙，顏色發(fā)暗，邊緣變鈍，表面有粟米大小暗黃色顆粒，質(zhì)硬脆;各給藥組動(dòng)物肝臟較光滑，色澤較模型組光亮，表面凸起較小、較淺，彈性較好。肝組織HE染色結(jié)果顯示，正常對照組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞排列規(guī)則，無肝纖維化病理情況出現(xiàn)(0.91±0.38);模型組肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，可見明顯纖維間隔形成，出現(xiàn)大量的膠原沉積，匯管區(qū)增粗，脂肪細(xì)胞多見(5.14±1.12);陽性對照組、醇提物組、黃堿組、黃酮高劑量組與低劑量組雖仍可見肝膠原沉積、纖維組織形成的現(xiàn)象，但范圍較小，出現(xiàn)的頻率較低(2.86 ±1.00，2.77 ±0.85，2.91 ±0.94，2.82 ±0.90，3.91±1.09);生物堿組肝纖維化的減輕程度不明顯，仍可見菲薄的纖維條索(4.27±1.13)。各給藥組對肝細(xì)胞脂肪變影響不大。對肝纖維化大鼠肝臟膠原纖維增生程度評(píng)分結(jié)果顯示，甘肅產(chǎn)藏藥MQR醇提物、黃堿組以及總黃酮能明顯緩解肝纖維化大鼠肝臟膠原纖維組織增生的程度。見圖1。

圖1 甘肅產(chǎn)藏藥五脈綠絨蒿對肝纖維化大鼠肝臟病理的影響(HE，×20)

3 討論

肝纖維化是肝組織對慢性損傷的修復(fù)反應(yīng)，是大多數(shù)慢性肝病共同的病理特征，目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為肝纖維化進(jìn)程可逆，預(yù)防和治療肝纖維化是肝病防治的重要環(huán)節(jié)〔6〕。CCl4為選擇性肝毒性藥物，在肝臟經(jīng)細(xì)胞色素P450激活后，與細(xì)胞膜脂質(zhì)和蛋白質(zhì)結(jié)合，引起膜結(jié)構(gòu)與功能的破壞而導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死，乙醇及其代謝物乙醛能夠直接誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞(HSC)活化和膠原纖維的生成，高脂低蛋白飼料導(dǎo)致三大營養(yǎng)物質(zhì)代謝失衡，因此，由CCl4、乙醇及高脂低蛋白飼料組成的復(fù)合因素致大鼠肝纖維化模型成模率更高、成模時(shí)間更短、模型更加穩(wěn)定，尤其是與肝纖維化臨床病變過程具有較高的相似性〔7〕，適用于肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的動(dòng)態(tài)觀察和研究〔8〕。本研究結(jié)果提示復(fù)合因素引起肝細(xì)胞受損明顯。

肝纖維化與脂質(zhì)過氧化之間有密切的內(nèi)在聯(lián)系。機(jī)體在生命過程中，通過抗氧化酶的系列催化反應(yīng)將自由基轉(zhuǎn)化為O2和CO2，抑制自由基啟動(dòng)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，保護(hù)生物膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性，抗氧化酶SOD與CAT等活性的高低可間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力;MDA是自由基脂質(zhì)過氧化的終末產(chǎn)物，其含量高低可間接反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度和體內(nèi)自由基過氧化的水平。目前認(rèn)為HSC的活化增殖是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)，肝臟是脂質(zhì)過氧化物降解的主要場所，肝臟發(fā)生病變、肝細(xì)胞受損時(shí)，必然導(dǎo)致自由基代謝紊亂。自由基除能直接作用于各種信號(hào)分子，促使HSC增殖與活化誘導(dǎo)肝纖維化的發(fā)生外，還能攻擊肝細(xì)胞的各種膜結(jié)構(gòu)，引起脂質(zhì)過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，脂質(zhì)過氧化損傷可刺激HSC等細(xì)胞的膠原基因與蛋白表達(dá)增加，最終導(dǎo)致肝纖維化的形成，研究〔9，10〕表明，活性氧自由基及其誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化是肝臟炎性損傷發(fā)展至肝纖維化的橋梁，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物是直接刺激膠原基因轉(zhuǎn)錄的重要因素。本研究也表明，甘肅產(chǎn)藏藥MQR醇提物、黃堿組以及總黃酮具有一定的抗氧化作用，可以通過減緩脂質(zhì)過氧化及MDA的生成，在肝纖維化形成的過程中減輕肝細(xì)胞的損傷，減少膠原產(chǎn)生，防止肝纖維化的進(jìn)一步發(fā)展。

自由基參與肝纖維化等多種病理過程，作為天然抗氧化劑的黃酮類化合物是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。前期研究表明〔3〕，甘肅產(chǎn)藏藥MQR總黃酮及其中的苜蓿素具有清除自由基及體外抗脂質(zhì)過氧化的作用。本次研究顯示甘肅產(chǎn)藏藥MQR醇提物及其中的總黃酮具有明顯的體內(nèi)抗氧化作用，該作用可能是其抗肝纖維化的重要機(jī)制之一。

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