TFAM重組腺病毒的構(gòu)建及其對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用

廖壯文 黃 彥 梁月屏 呂浩然 張珠江 (廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨外科，廣東 廣州 510260)

關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的過(guò)度凋亡是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的重要病理機(jī)制，而軟骨細(xì)胞的凋亡與線粒體關(guān)系密切，線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(TFAM)是線粒體轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的關(guān)鍵激活子，與細(xì)胞凋亡過(guò)程相逆〔1〕。TFAM具有調(diào)節(jié)線粒體DNA的拷貝數(shù)，維護(hù)線粒體DNA完整、穩(wěn)定以及促進(jìn)損傷修復(fù)的功能〔2〕。前期研究表明骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞TFAM的表達(dá)降低。因此本研究構(gòu)建含有TFAM基因的重組腺病毒載體，通過(guò)轉(zhuǎn)染骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞，以正向增強(qiáng)其在軟骨細(xì)胞中的表達(dá)，觀察TFAM在保護(hù)軟骨細(xì)胞退變過(guò)程中的作用，為利用TFAM在逆轉(zhuǎn)軟骨細(xì)胞凋亡、最終治療骨關(guān)節(jié)炎提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例來(lái)源 選擇我院2011年10月至2012年10月的膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎患者20例，所有病例均符合骨關(guān)節(jié)炎診治指南(2007 年版)的診斷標(biāo)準(zhǔn)〔3〕。

1.1.2 主要試劑 攜帶TFAM基因的重組腺病毒(Ad-TFAM)由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建及擴(kuò)增純化，Ad-BMP7滴度1×109pfu/ml。山羊抗TFAM單克隆抗體(SantaCruz公司)，TRIzol試劑盒(Gibco公司)，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒為公司產(chǎn)品，RT-PCR引物由百替生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 收集樣本和建立軟骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系 無(wú)菌條件下取膝骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)置換術(shù)中取下關(guān)節(jié)軟骨后立即置入盛有含青霉素鈉/鏈霉素雙抗液的PBS無(wú)菌培養(yǎng)皿中，無(wú)菌生物柜取材術(shù)中切除的關(guān)節(jié)全層軟骨片(去除周圍附著的軟組織)，無(wú)菌手術(shù)刀片切塊、剪碎，加入PBS液沖洗，將軟骨移入離心管中，加入Ⅱ型膠原酶，37℃培養(yǎng)箱中消化，其中2 h后每隔20 min晃動(dòng)1次離心管，至懸液變混濁確定為軟骨塊基本被消化。之后離心，棄上清液。加入完全培養(yǎng)基，充分吹打混勻后可獲得含有軟骨細(xì)胞的懸液。

1.2.2 Ad-TFAM骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞 選取0.5×105個(gè)/ml的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期傳代骨關(guān)節(jié)炎患者的軟骨細(xì)胞懸液接種于24孔培養(yǎng)板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)恒溫箱中培養(yǎng)過(guò)夜。24 h后并立即用事先預(yù)熱到 37℃的新鮮空白培養(yǎng)基 LV-EGFP按感染復(fù)數(shù)即MOI=1、10、50、100、500、1 000、104，AV-EGFP 按相應(yīng)的 MOI值稀釋病毒，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組(MOI=0)。將稀釋好的不同濃度病毒液加入細(xì)胞中，放回恒溫培養(yǎng)箱。達(dá)到規(guī)定時(shí)間后，吸去含病毒的培養(yǎng)液，換上新鮮的完全培養(yǎng)液，繼續(xù)在恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。以后每2～3 d換液1次。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中TFAM mRNA的表達(dá)水平 取轉(zhuǎn)染腺病毒72 h后的MOI值為500、1 000的兩組骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨細(xì)胞和空白對(duì)照組，采用TRIzol法抽提總RNA，將 RNA反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。取1 μl作為模板進(jìn)行 RT-PCR反應(yīng)。TFAM上游引物5'-GGAATGTGGAGCGTGCTAAAA-3'，下游引物 5'-TGCTGGAAAAACACTTCGGAATA-3'，片段長(zhǎng)度 118 bp。β-actin上游引物 5'-TTCGAGCAAGAGATGGCCA-3'，下游引物 5'-TACATGGTGGTGCCGCC-3'，片段長(zhǎng)度270 bp。RT-PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性 5 min;95℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃延伸 1 min(30個(gè)循環(huán));72℃終延伸10 min。

1.2.4 Western印跡檢測(cè)細(xì)胞中TFAM蛋白的表達(dá)水平 取轉(zhuǎn)染腺病毒72 h后的MOI值為500、1 000的兩組骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨細(xì)胞和空白對(duì)照組，每個(gè)孔加入細(xì)胞裂解液，充分作用后放置冰上;用小刮匙將裂解物刮下，收集入EP管中，－80℃凍存。采用Western印跡檢測(cè)TFAM蛋白的變化，SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜與封閉，一抗及二抗孵育。在凝膠成像儀上掃描條帶，以其和內(nèi)參β-actin、GAPDH吸光度值的比值來(lái)反映其相對(duì)含量。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)線粒體DNA拷貝數(shù) 細(xì)胞線粒體DNA的提取:加RNase(200 μg/ml)于37℃消化RNA。之后用酚、酚/氯仿、異戊醇(體積比為25∶24∶1)DNA以去除蛋白質(zhì)、脂類等其他物質(zhì)。純化后的線粒體DNA量較少，線粒體DNA溶液加入0.6倍體積異丙醇或沉淀緩沖液，置于－20℃下放置30 min，進(jìn)行離心即得純凈的線粒體DNA。

線粒體DNA拷貝數(shù)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè):以線粒體DNA HV1和核單拷貝基因β-globin分別作為線粒體和核DNA拷貝數(shù)的標(biāo)記。設(shè)計(jì)HV1和β-globin基因的引物及探針，對(duì)該基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的基礎(chǔ)之上，分別對(duì)待測(cè)樣本線粒體HV1和β-globin基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。線粒體DNA的拷貝數(shù)計(jì)算公式:相對(duì)拷貝數(shù)/二倍體核基因組 =2 ×HV1/β-globin。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行方差分析。計(jì)數(shù)資料用χ2分析，計(jì)量資料以±s表示。

2 結(jié)果

2.1 Ad-TFAM對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率鑒定 Ad-TFAM骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞后，經(jīng)免疫熒光染色，呈現(xiàn)綠色熒光為陽(yáng)性細(xì)胞，未感染的細(xì)胞無(wú)著色現(xiàn)象。隨著MOI的增加，染色陽(yáng)性率亦增加，當(dāng)MOI=1 000時(shí)關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞熒光著色陽(yáng)性率達(dá)96%(見(jiàn)圖1)，說(shuō)明本方法構(gòu)建重組腺病毒體外轉(zhuǎn)染率高，目的基因能有效地得以表達(dá)。

圖1 TFAM重組腺病毒對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率

2.2 RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中TFAM mRNA的表達(dá)水平 總RNA樣本純度高，且所取組織RNA無(wú)降解，28 s rRNA、18 s rRNA條帶清晰，5 s rRNA條帶不明顯(圖2)，置于紫外分光光度計(jì)上波長(zhǎng)為260 nm和280 nm處測(cè)量吸光值，兩者比值均在1.7～2.0。RT-PCR結(jié)果顯示細(xì)胞轉(zhuǎn)染TFAM重組腺病毒后MOI為500、1 000組TFAM mRNA的表達(dá)明顯升高(P＜0.01)，說(shuō)明轉(zhuǎn)染Ad-TFAM后的軟骨細(xì)胞中有TFAM目的基因mRNA水平的表達(dá)，見(jiàn)圖3。

圖2 總RNA提取

圖3 骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染后TFAM mRNA的表達(dá)水平

2.3 Western印跡檢測(cè)細(xì)胞中TFAM蛋白的表達(dá)水平 Western印跡結(jié)果表明骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染TFAM重組腺病毒72 h后MOI為500、1 000兩組，TFAM蛋白表達(dá)均升高，其中MOI=1 000組表現(xiàn)最為明顯(P＜0.01)，見(jiàn)圖4。

圖4 骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染后TFAM蛋白的表達(dá)水平

2.4 線粒體DNA拷貝數(shù)變化 根據(jù)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)得的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù) (Ct)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，呈直線相關(guān)。HV1和β-globin基因定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)分別為0.996和0.998，斜率分別為－3.148和－3.369。骨關(guān)節(jié)炎細(xì)胞組線粒體DNA的平均拷貝數(shù)為(389±117)，而MOI=500組為 (575±144)，MOI=1 000組為 (762±179)，前者顯著低于后兩者 (P＜0.01)。

3 討論

軟骨細(xì)胞的凋亡與線粒體有密切的關(guān)系〔3〕。Musumeci等〔4〕研究認(rèn)為，線粒體的功能障礙是破壞了軟骨細(xì)胞在關(guān)節(jié)內(nèi)微環(huán)境，從而導(dǎo)致了骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。Blanco等〔5〕認(rèn)為在骨關(guān)節(jié)炎的軟骨細(xì)胞線粒體功能障礙可能來(lái)自體細(xì)胞中的線粒體DNA突變或炎癥介質(zhì)的直接影響，導(dǎo)致其合成和生長(zhǎng)的缺陷，最終使軟骨基質(zhì)鈣化和軟骨細(xì)胞凋亡的增加。線粒體的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程需要核編碼的一些轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行調(diào)控。在哺乳動(dòng)物中已經(jīng)鑒定出兩種轉(zhuǎn)錄因子:TFAM和TFBM〔6〕。在哺乳動(dòng)物線粒體的功能活動(dòng)中起主要調(diào)節(jié)作用的因子是TFAM〔7〕。

Kim等〔8〕研究認(rèn)為保持線粒體DNA的完整性是必要的，這樣可以防止軟骨細(xì)胞中IL-1β和TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。呂紅斌等〔9〕發(fā)現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病與關(guān)節(jié)軟骨中軟骨細(xì)胞線粒體DNA的突變關(guān)系密切。TFAM具有調(diào)節(jié)線粒體DNA的拷貝數(shù)的功能，Rebelo等〔10〕研究認(rèn)為TFAM與線粒體DNA在線粒體中結(jié)合成復(fù)合體，從而保持線粒體DNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，Ekstrand等〔11〕認(rèn)為在小鼠中過(guò)表達(dá)人類的TFAM會(huì)導(dǎo)致線粒體DNA拷貝數(shù)的增加，但不會(huì)增加線粒體呼吸鏈的含量或者線粒體的總量;TFAM還可維護(hù)線粒體DNA的完整和穩(wěn)定，林恒等〔12〕探討發(fā)現(xiàn)阻斷目的基因TFAM的表達(dá)使得rhALR對(duì)梗阻性黃疸大鼠肝功能的保護(hù)作用消失;TFAM促進(jìn)線粒體DNA的損傷修復(fù)，Nakanishi等〔13〕研究后認(rèn)為TFAM可以改善線粒體DNA的損傷和減少，由此產(chǎn)生的氧化還原調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng);Woo等〔14〕研究了敲除線粒體TFAM基因的小鼠，發(fā)現(xiàn)其線粒體DNA出現(xiàn)缺失，同時(shí)出現(xiàn)線粒體的氧化損傷。本研究結(jié)果提示轉(zhuǎn)染AdTFAM可正向增強(qiáng)其在軟骨細(xì)胞中的表達(dá)，保持線粒體DNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，TFAM在保護(hù)軟骨細(xì)胞退變過(guò)程中起重要作用，從而促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)。

綜上所述，AdTFAM載體轉(zhuǎn)染骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞，證實(shí)TFAM保護(hù)軟骨細(xì)胞退變的作用。為利用TFAM在逆轉(zhuǎn)軟骨細(xì)胞凋亡、最終治療骨關(guān)節(jié)炎提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。這將可以對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的病因提出新的解釋，為骨關(guān)節(jié)炎的治療提供新的途徑，對(duì)社會(huì)產(chǎn)生巨大影響。

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