慢性憤怒應激對腦老化大鼠學習記憶及海馬神經(jīng)元的影響

詹向紅 劉勝利 李 偉 王淑玲 趙君玫 王友杰 劉高建 王慧霞 韓賀云(河南中醫(yī)學院，河南 鄭州 450046)

隨著生活節(jié)奏加快，社會競爭日趨激烈，情緒沖突和心理應激逐漸增多。研究發(fā)現(xiàn)，心理應激嚴重危害人類身心健康，使機體衰老過程加速，學習記憶能力下降。憤怒是負性情緒的核心〔1〕，許多重大的身心疾病都可以追溯到情緒的調(diào)節(jié)不良，臨床常見長期憤憤不平的個體較易出現(xiàn)學習記憶能力的衰退。海馬是學習記憶的關鍵部位，對情緒應激反應非常敏感且極易受損〔2，3〕，海馬損傷必將加速腦老化進程。因此，憤怒情緒長期積累可能是腦老化加速的重要原因之一。本文選用大鼠尋臺時間(SPL)、海馬神經(jīng)元線粒體膜電位(MMP)、凋亡百分率(APOP)作為指標，探討慢性憤怒應激對衰老及腦老化大鼠學習記憶的影響及部分機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物及分組 Wistar雄性大鼠56只，SPF級3月齡，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司(SCXK(京)2006-0009)，體重為360±10 g。在河南省食品藥品檢驗所動物實驗中心屏障環(huán)境設施動物實驗室(SYXK(豫)2005-0011)進行實驗，并由該實驗室提供標準實驗動物滅菌飼料。正常飼養(yǎng)3日后，按體重隨機分為空白對照組、D-gal衰老及腦老化模型組(簡稱模型組)、慢性憤怒應激組(簡稱憤怒應激組)3組，每組14只，其余14只作為攻擊鼠。各組分籠飼養(yǎng)，自由飲食飲水。(注:模型組予以注射D-gal，憤怒應激組在注射D-gal基礎上引入憤怒刺激。)

1.1.2 主要試劑及儀器 大鼠海馬神經(jīng)元凋亡試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號:091113);大鼠海馬神經(jīng)元線粒體膜電位試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號:091113);FACSCalibur流式細胞儀(美國BD公司);HPS-250生化培養(yǎng)箱(哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司);Morris水迷宮(成都泰盟科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 D-gal衰老模型 參考李文彬等〔4〕D-gal衰老及腦老化造模方法，模型組和憤怒應激組注射D-gal溶液，制作衰老及腦老化模型。具體方法:將D-gal溶于生理鹽水，濃度為2%，注射容量為0.01 ml·g-1，每日1次，頸后部皮下注射，空白對照組注射同體積生理鹽水，連續(xù)6 w。每周測體重1次，依所測體重計算注射容量。

1.2.2 憤怒應激組引入憤怒刺激的方法課題組在夾尾間接激怒法基礎上〔4〕，受傳統(tǒng)直接電擊法的啟發(fā)，創(chuàng)立一種新型誘發(fā)大鼠憤怒情緒的方法--間接電擊激怒法。自實驗第3周始每天下午3點對憤怒應激組大鼠進行憤怒刺激。具體方法:使用特制電刺激儀作為電刺激工具，把憤怒應激組大鼠單獨放入特制金屬籠內(nèi)，再隨機放進一只攻擊鼠，用一端電極觸碰攻擊鼠前部(電極的另一端與金屬籠相連以構成回路)，攻擊鼠受電擊被激惹，對憤怒應激組大鼠發(fā)起攻擊，雙方互相撕咬、對峙，產(chǎn)生憤怒心理和行為。頻率為1～2次/min，每天刺激15 min，連續(xù)4 w。最后攻擊鼠丟棄不用。

1.2.3 標本采集及制備 實驗至第37天始，進行Morris水迷宮測試，為期6 d。至第42天完成實驗后，禁食24 h，按每100 g體重注射0.5～0.8 ml 20%烏拉坦;然后用手術剪迅速剝離頭部，置于冰塊上，取出腦組織，用眼科鑷沿正中矢狀線分開端腦，剝離出海馬，取出海馬CA1區(qū)組織，剪切、研磨后用不含EDTA的胰酶消化收集，最后由尼龍網(wǎng)過濾即可得到單細胞懸液，懸液通過流式細胞儀分析其結果。

1.3 統(tǒng)計學方法實驗結果用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包進行處理。數(shù)值變量以±s進行統(tǒng)計描述，組間均數(shù)差異的比較，正態(tài)分布和方差符合齊性檢驗后，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩兩比較用LSD法。

2 結果

2.1 慢性憤怒應激對D-gal大鼠空間學習記憶能力的影響表1顯示的是Morris水迷宮第6天的測試結果:憤怒應激組較模型組大鼠SPL明顯延長(P＜0.05)。

2.2 慢性憤怒應激對D-gal大鼠海馬神經(jīng)元MMP、APOP的影響 與模型組相比，憤怒應激組大鼠海馬神經(jīng)元MMP下降有邊緣顯著性(0.05＜P＜0.1);憤怒應激組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡百分率升高(P＜0.01)。見表1。

表1 各組大鼠學習記憶能力及海馬神經(jīng)元MMP、APOP的比較(±s)

表1 各組大鼠學習記憶能力及海馬神經(jīng)元MMP、APOP的比較(±s)

與空白對照組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與D-gal組比較:3)P＜0.05，4)P ＜0.01

組別 n SPL(s) MMP(%) APOP(%)空白對照組14 10.56±4.18 80.74±13.59 1.02±0.47模型組 14 15.55±5.121)69.83±12.461)1.83±0.472)憤怒應激組 14 19.95±5.652)3)60.73±15.662)3.37±0.752)4)

3 討論

憤怒是負性情緒的核心，對個體及社會的危害尤為突出，許多重大的心身疾病可以追溯到情緒的長期憤憤不平。怒是對人際關系與社會和諧影響最大的情緒反應之一，有國外學者指出，具有憤怒傾向的人群更易出現(xiàn)負面健康問題〔5〕。現(xiàn)代醫(yī)學研究表明，腦耗氧量占全身的20%，所需血流量占心搏出量的15%～20%，對氧氣、血液供應量的減少極為敏感。中醫(yī)認為，頭為諸陽之會，五臟精華之血，六腑清陽之氣皆匯聚于腦，方有神明之用;肝主疏泄，在志為怒，怒傷肝，長期或劇烈的憤怒情緒會阻礙肝疏泄氣機的功能，使氣機逆亂。氣血不能正常輸布于腦，腦失濡養(yǎng)，久之必然加速腦老化進程。

學習記憶能力減退是衰老尤其是腦老化的重要表現(xiàn)，臨床上腦老化患者可呈現(xiàn)進行性精神狀態(tài)衰變，包括遠近期記憶力障礙、情緒改變、分析判斷能力衰退、行為失常等。本研究借助Morris水迷宮實驗檢測動物空間定位與學習記憶能力，結果顯示:憤怒應激組較模型組SPL明顯延長，表明持續(xù)的憤怒應激加重D-gal衰老大鼠空間學習能力減退的程度，提示慢性憤怒應激加速了大鼠腦老化進程。

線粒體是細胞內(nèi)的重要器官，是細胞呼吸代謝的中心，也是細胞產(chǎn)生能源的主要場所，與生命活動關系密切，對損傷的反應也極為敏感。線粒體異常參與神經(jīng)系統(tǒng)退變性疾病的發(fā)生，氧化應激極易使神經(jīng)元線粒體內(nèi)膜發(fā)生脂質過氧化損傷，致使MMP下降，MMP下降被認為是促使細胞凋亡級聯(lián)反應的重要因素。細胞凋亡學說認為，細胞凋亡參與人體的許多重要生理、病理過程，它通過破壞重要的不可替代的細胞引起或加速衰老，主要有兩種形式:一是清除己經(jīng)受損和功能障礙的細胞，清除后的空間由纖維組織填充，繼續(xù)維持機體的穩(wěn)定狀態(tài);二是清除不能再生的細胞，它們的數(shù)量逐步減少，導致病理改變〔7〕。細胞凋亡的結果使不可再生且具有重要功能的細胞數(shù)量減少，如心肌細胞減少導致心功能不全，腦細胞減少造成腦萎縮等，這些細胞的凋亡加速機體老化。在探討MMP與APOP關系的研究中，有學者認為，MMP下降是APOP發(fā)生的重要因素之一〔8〕。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，模型組大鼠SPL延長，海馬神經(jīng)元MMP下降、APOP增加，提示長期大劑量注射D-gal引起大鼠海馬功能性與器質性損傷，空間學習記憶能力下降，D-gal衰老及腦老化模型成功。與模型組相比，憤怒應激組MMP下降呈邊緣顯著性，邊緣顯著性指統(tǒng)計結果顯示事件偶然發(fā)生的概率在5% ～10%，既結果幾乎顯著，但又未達到顯著，國外部分研究者把這類結果當作達到了0.05水平來討論。本研究結果提示慢性憤怒應激加重D-gal腦老化大鼠擬老化程度，加速了大鼠腦老化進程。

綜上，慢性憤怒應激降低D-gal衰老及腦老化大鼠空間定位與學習記憶能力，加速腦老化進程;海馬CA1區(qū)神經(jīng)元MMP下降，APOP上升可能是慢性憤怒應激加速腦老化進程的機制之一。

1 詹向紅，李 偉，徐瑋瑋，等.慢性憤怒應激對衰老大鼠學習記憶能力的影響及其脂質過氧化機制〔J〕.中國老年學雜志，2010;30(6):752-3.

2 Mc Ewen BS，Magarinos AM.Stress effects on morphology and function of the hippocampus〔J〕.Ann N Y Acad Sci，1997;821:271-84.

3 De Kloet ER，Vreugdenhil E，Oitzl MS，et al.Brain corticosteroid receptor，balance in health and disease〔J〕.Endocr Rev，1998;19(3):269-301.

4 李文彬，韋 豐，范 明，等.D-半乳糖在小鼠上誘導的擬腦老化效應〔J〕.中國藥理學與毒理學雜志，1995;9(2):93-5.

5 Williams JE，Johnson AM，Heiss G，et al.Association between exposure to combat-related stress and psychological health in aging men:the Atherosclerosis Risk in Communities(ARIC)Study〔J〕.J Trauma Stress，2010;23(3):358-66.

6 Kalichman MW，Powell HC，Mizisin AP.Reactive，degenerative，and proliferative Schwann cell responses in experimental galactose and human diabetic neuropathy〔J〕.Acta Neuropathol，1998;95(1):47-56.

7 Warner HR，Hodes RJ，Pocinke K.What Does Cell Death Have to do With Aging?〔J〕.J am Geriatr Soc，1997;45(9):1140-6.

8 連超群，張 靜，陳振東，等.茶多酚誘導人膽囊癌細胞GBC-SD凋亡過程中細胞內(nèi)游離鈣離子濃度及線粒體膜電位的變化〔J〕.中國生物制品學雜志，2012;25(4):449-52.