阿司匹林誘導(dǎo)宮頸癌Hela細胞凋亡及相關(guān)機制

王 蓓 李建立 賈立剛 黃 黛 李紅艷 閆 萍 秦 英 邢邯英(河北省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北 石家莊 05005)

阿司匹林為非甾體類消炎藥，最近流行病學(xué)研究證實阿司匹林及其他非甾體類消炎藥具有降低腫瘤發(fā)病率的作用〔1～3〕。本研究以人宮頸癌Hela細胞為研究對象，探討阿司匹林對Hela細胞凋亡的影響及其機制。

1 資料與方法

1.1 細胞系、藥物及試劑 人宮頸癌Hela細胞，購自河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心。阿司匹林購自美國Sigma公司;RPMI-1640培養(yǎng)基為Hyclone產(chǎn)品;PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞常規(guī)培養(yǎng)和實驗分組 接種宮頸癌Hela細胞于含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37℃，5%CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞貼壁生長約90%融合時，以0.25%胰酶消化，每周傳代2～3次。

實驗分為對照組和阿司匹林干預(yù)組:①對照組:取對數(shù)生長期的Hela細胞以5×105/瓶的密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，24 h后更換含1% 乙醇的RPMI-1640培養(yǎng)基，然后繼續(xù)培養(yǎng)48 h;②阿司匹林干預(yù)組:細胞接種24 h后更換含有阿司匹林濃度分別為1.0、5.0、10.0 mmol/L的RPMI-1640培養(yǎng)基(阿司匹林純品溶于無水乙醇中，過濾除菌，再用RPMI-1640培養(yǎng)基分別配置成終濃度為1、5、10 mmol/L，無水乙醇最大濃度為1%)，再置于37℃，CO2含量5%飽和濕度的培養(yǎng)箱中48 h。

1.2.2 流式細胞儀檢測Hela細胞凋亡和細胞周期 收集細胞并用70% 的預(yù)冷酒精固定。采用碘化丙啶(PI)一步插入法DNA定量熒光染色方法，染液中含 PI 50 mg/ml，RNA酶10 μl/ml，Triton-X100 1.0%。上機前先除去樣本中70%的乙醇，調(diào)整每份樣品的細胞數(shù)為1×106個。每份樣本中加入DNA染液500 μl，在4℃冰箱染色30 min，以500目銅網(wǎng)過濾成單細胞懸液。FACS-420型流式細胞儀分析細胞凋亡率和細胞周期，每份樣本檢測1×104個細胞，每組共檢測6個樣本，重復(fù)3遍。測得的數(shù)據(jù)和圖形輸入BD公司提供的流式細胞分析軟件，以低于G1期DNA含量細胞為凋亡細胞，應(yīng)用相應(yīng)程序進行資料處理。

1.2.3 RT-PCR技術(shù)檢測凋亡相關(guān)基因bcl-2和bax表達的變化 Trizol一步法提取各組細胞總RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)總體積為25 μl，包括 RNA 2 μg。取逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，分別進行bcl-2和 bax基因的擴增。bcl-2引物序列:上游引物 5'-CGACTTCGCCGAGATGTCCAGCCAG-3';下游引物5'-ACTTGTGGCCCAGATAGGCACCCAG-3'，擴增片段長度為:389 bp。bax引物序列:上游引物5'-tttgcttcagggtttcatcc-3'，下游引物5'-cagttgaagttgccgtcaga-3'，擴增片段長度為246 bp。擴增產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖電泳，UVP凝膠顯像儀掃描并進行圖像分析。用目的基因與β-actin吸光度的比值代表目的基因的相對表達含量。

2 結(jié)果

2.1 阿司匹林誘導(dǎo)Hela細胞凋亡結(jié)果各劑量的阿司匹林作用Hela細胞48 h后，在DNA直方圖上G1期峰前出現(xiàn)明顯的細胞凋亡峰即亞G1期峰，說明阿司匹林可誘導(dǎo)Hela細胞凋亡。與對照組凋亡率(4.13% ±0.76%)相比，阿司匹林干預(yù)組Hela細胞凋亡率(11.71% ±0.86%，18.15% ±0.46%，30.81% ±0.46%)明顯增高(P＜0.05)，且隨濃度增加凋亡率也隨之增加。

2.2 阿司匹林對Hela細胞周期的影響 Hela細胞經(jīng)不同濃度阿司匹林作用48 h后，細胞周期發(fā)生明顯改變(表1)，隨著阿司匹林濃度增加，G0/G1期細胞比例下降，G2/M期細胞比例升高(P＜0.05)。

表1 各組細胞細胞周期比較(± s，n=6)

表1 各組細胞細胞周期比較(± s，n=6)

與對照組比較:1)P＜0.01;與阿司匹林干預(yù)組(1.0 mmol/L)比較:2)P＜0.05

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2.3 阿司匹林對Hela細胞bcl-2和bax基因mRNA表達的影響 圖 1，圖 2可見，對照組 bcl-2/β-actin的 IOD比值為(0.725±0.332)，1.0、5.0 mmol/L濃度的阿司匹林作用后Hela細胞的bcl-2表達均明顯下調(diào)，IOD比值分別達到(0.241±0.113)和(0.584±0.18)，與對照組相比有顯著差異(P＜0.05)。對照組Hela細胞的bax條帶的積光密度標化后為(0.222±0.12)，1.0、5.0 mmol/L濃度的阿司匹林作用后 Hela細胞的bax條帶的積光密度標化后分別為(0.129±0.217)和(0.644±0.24)，較對照組表達明顯升高(P＜0.05)。

圖1 各組細胞bcl-2 mRNA的RT-PCR擴增結(jié)果

圖2 各組細胞bax mRNA的RT-PCR擴增結(jié)果

3 討論

本實驗是以阿司匹林能夠?qū)Χ喾N腫瘤細胞有較好的抑制作用為科研基礎(chǔ)〔4～6〕，以相關(guān)文獻報道阿司匹林能夠誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡為依據(jù)〔7〕，以阿司匹林能否直接抑制體外培養(yǎng)的宮頸癌細胞株增殖生長，誘導(dǎo)癌細胞凋亡為切入點〔8〕。阿司匹林具有抗結(jié)腸癌、胃癌、食管癌的作用，但有關(guān)阿司匹林抗宮頸癌的研究國內(nèi)外還很少。本實驗結(jié)果顯示阿司匹林可誘導(dǎo)宮頸癌Hela細胞凋亡。近年來許多文獻報道，DNA損傷因子包括化療藥物和放療等，在損傷DNA的同時還可以引起腫瘤細胞在G2/M期阻滯，甚至誘導(dǎo)細胞凋亡〔9〕。本實驗結(jié)果提示阿司匹林作用于Hela細胞在細胞進入DNA合成后期可引起DNA損傷，使細胞停滯在 G2/M 期〔10〕。而朱慧明等〔5〕發(fā)現(xiàn)阿司匹林使人肺腺癌細胞株SPCA-1在G0/G1期增多，S期和G2/M期細胞減少。

為進一步探討阿司匹林誘導(dǎo)Hela細胞凋亡的機制，本實驗研究了不同濃度阿司匹林作用于Hela細胞前后，bcl-2和bax基因mRNA表達的變化。bcl-2基因蛋白是一種細胞內(nèi)膜蛋白，主要位于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜上。bcl-2表達于多種腫瘤組織中，它的抗凋亡機制是因為bcl-2基因蛋白能夠增強線粒體膜電位，抑制鈣離子釋放，阻止核酸內(nèi)切酶活化，從而具有抗凋亡作用。Bax屬于bcl-2家族成員，其作用與bcl-2相反，可促進細胞凋亡。bax蛋白的組織表達與分布與bcl-2相似，其促凋亡機制是直接激活死亡效應(yīng)因子caspases或是通過改變細胞膜通透性引起細胞色素C釋放并使某些離子和小分子物質(zhì)通過細胞膜。體內(nèi)bcl-2和bax的比例調(diào)節(jié)了凋亡的發(fā)生。當bcl-2過度表達時，細胞具有抗凋亡作用;當bax占優(yōu)勢時，細胞容易在誘導(dǎo)劑的作用下發(fā)生凋亡。本實驗表明阿司匹林誘導(dǎo)宮頸癌細胞凋亡是通過下調(diào)bcl-2和上調(diào)bax的基因表達來實現(xiàn)的，并且隨著阿司匹林濃度的升高，下調(diào)bcl-2基因表達及上調(diào)bax基因表達的作用越明顯。

1 Xiang S，Sun Z，He Q，et al.Aspirin inhibits ErbB2 to induce apoptosis in cervical cancer cells〔J〕.Med Oncol，2010;27(2):379-87.

2 許 紅，安翠平，陳瑞敏.阿司匹林對卵巢癌細胞凋亡及Bcl-2/bax基因mRNA表達的影響〔J〕.河北醫(yī)藥，2009;31(4):404-6.

3 Lee SK，Park MS，Nam MJ.Aspirin has antitumor effects via expression of calpain gene in cervical cancer cells〔J〕.J Oncol，2008;2008:285374.

4 Gupta RA，Tejada LV.Cyclooxygenase-1 is overexpressed and promotes angiogenic growth factor production in ovarian cancer〔J〕.Cancer Res，2003;63(3):906-11.

5 朱慧明，吳 鐵，崔 燎.阿司匹林誘導(dǎo)人肺腺癌細胞株SPC-1凋亡研究〔J〕.中國藥理學(xué)通報，2004;20(6):640-3.

6 Li S，Miner K，F(xiàn)annin R.Cyclooxygenase-1 and 2 in normal malignant human ovarian epithelium〔J〕.Gynecol Oncol，2004;92(2):622-7.

7 Morré DJ，Morre DM.tNOX，an alternative target to COX-2 to explain the anticancer activities of non-steroidal anti-inflammatory drugs(NSAIDS)〔J〕.Mol Cell Biochem，2006;283(1-2):159-67.

8 鄭秀娟，李淞漪.阿司匹林對宮頸癌Hela細胞COX-2mRNA表達的抑制作用〔J〕.浙江臨床醫(yī)學(xué)，2007;9(11):1461-2.

9 Kutuk O，Basaga H.Aspirin inhibits TNFα-and IL-1-induced NF-κB activation and sensitizes Hela cells to apoptosis〔J〕.Cytokine，2004;25:229-37.

10 趙 健，曹澤毅，廖秦平，等.阿司匹林對宮頸癌細胞系Caski的生長抑制作用〔J〕.中國婦產(chǎn)科臨床雜志，2003;4(1):37-9.