福州市發(fā)生由木爾坦棉花曲葉病毒引起的朱槿曲葉病

章松柏， 夏宣喜， 張 潔， 張友軍， 吳祖建＊

（1.福建農(nóng)林大學(xué)植物病毒研究所，福州 350002；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081；3.長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，荊州 434025）

棉花曲葉?。╟otton leaf curl disease）是世界棉花生產(chǎn)上最具毀滅性的病毒病害，已在巴基斯坦、印度、蘇丹、埃及和南非等國(guó)棉花產(chǎn)區(qū)廣泛流行，僅在1992－1997年期間就造成巴基斯坦經(jīng)濟(jì)損失累計(jì)達(dá)50億美元［1－4］。棉花曲葉病是多種雙生病毒引起，這些雙生病毒都屬于雙生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus）成員［3，5－6］，皆由煙粉虱［Bemisia tabaci （Genn.）］以持久方式傳播，也可以嫁接傳播，但不能通過(guò)機(jī)械摩擦接種傳播和種子帶毒傳播；其基因組僅含有DNA－A組分，并伴隨衛(wèi)星β分子［3－4］。鑒于棉花曲葉病的危害性，2007年5月28日正式發(fā)布實(shí)施的《中華人民共和國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》中，再次將其列入植物檢疫對(duì)象。盡管如此，棉花曲葉病的主要病原之一，木爾坦棉花曲葉病毒，還是很快在我國(guó)朱槿（Hibiscus rosa－sinensis Linn.）植物上被發(fā)現(xiàn)［7］，經(jīng)過(guò)不到8年的擴(kuò)散，該病毒已經(jīng)在我國(guó)廣東、廣西、海南等省多個(gè)地理區(qū)域的多種植物上流行危害，其他省市，包括我國(guó)長(zhǎng)江流域、黃河流域和西北內(nèi)陸三大棉花產(chǎn)區(qū)尚未發(fā)現(xiàn)棉花曲葉?。?－11］。因此，密切監(jiān)視和防控CLCuMV引起的病害擴(kuò)散是各級(jí)植保植檢部門(mén)和科研工作者的重要任務(wù)。2011－2012年，實(shí)驗(yàn)室科研人員先后于福建省廈門(mén)、福州、寧德等市公路綠化帶發(fā)現(xiàn)朱槿曲葉病疑似病株，并詳細(xì)調(diào)查了該病在福州市的發(fā)生情況。經(jīng)過(guò)調(diào)查發(fā)現(xiàn)福州市城市道路、公園、工廠、學(xué)校、政府機(jī)關(guān)等多數(shù)存在朱槿植物的綠化帶以及位于市郊的絕大多數(shù)苗圃基地皆存在疑似病株，經(jīng)過(guò)分子檢測(cè)和序列比較，證實(shí)該病害病原為木爾坦棉花曲葉病毒，傳毒介體為B型煙粉虱，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

植物樣品：朱槿曲葉病疑似病株葉片和健株葉片采集于福州市郊區(qū)苗圃基地，液氮速凍后保存于－70℃超低溫冰箱中備用，陽(yáng)性對(duì)照樣品為已經(jīng)鑒定的苧麻花葉病毒病病株。

介體昆蟲(chóng)：煙粉虱種群分別采自福州市郊區(qū)朱槿健株和疑似病株以及煙草上，收集于含75%乙醇的1.5mL離心管中，保存于－70℃超低溫冰箱或－20℃冰箱中備用。

1.2 實(shí)地調(diào)查和癥狀觀察

調(diào)查福州市種植朱槿的公園、道路、單位和苗圃基地，走訪苗圃基地花農(nóng)，記錄朱槿曲葉病的發(fā)生時(shí)間和可能的傳入途徑；對(duì)照健康植株，觀察發(fā)病朱槿植株葉片是否畸形和黃化，葉片大小是否變化，葉背有無(wú)耳突，葉脈是否增厚等，植株是否矮化等。

1.3 植物總DNA和煙粉虱DNA的提取

采用周雪平等報(bào)道的CTAB提取法［12］提取朱槿葉片中的總DNA（總共有14份植物樣品，包括病葉樣品12份、健葉樣品1份，對(duì)照樣品1份）。

煙粉虱生物型的鑒定使用多頭昆蟲(chóng)（30～50頭）提取的DNA，方法如下：將煙粉虱置于1.5mL離心管中，液氮速凍后，用研磨棒研磨成粉狀，加入含200μL 堿 裂 解 液 （50mmol／L Tris－HCl，pH 8.0，20mmol／L NaCl，1mmol／L EDTA，1%SDS）和1μL蛋白酶K（終濃度1μg／mL），55℃水浴鍋中水浴2～3h；離心（12000r／min，下同）5min后取上清，加入200μL 24∶1的氯仿／異戊醇抽提，重復(fù)1次；離心5min后取上清，加入等體積的異丙醇，－20℃放置20min；離心10min，去上清，沉淀用70%乙醇洗1次，然后將DNA沉淀室溫晾干，加入60μL ddH2O溶解后即可用于PCR反應(yīng)。煙粉虱帶毒率監(jiān)測(cè)使用朱槿曲葉病病株上采集的煙粉虱，單頭煙粉虱總DNA的提取方法參照潘慧鵬等［13］。

1.4 PCR擴(kuò)增和電泳

利用Shatters等［14］基于B型和Q型煙粉虱mtDNA COⅠ基因片段設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增特異性引物來(lái)鑒定煙粉虱的生物型是B型還是Q型；利用謝艷等［15－16］設(shè)計(jì)的雙生病毒通用引物來(lái)檢測(cè)福州朱槿曲葉病是否由雙生病毒引起，并在序列分析的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)擴(kuò)增DNA－A余下片段的引物。PCR熱循環(huán)程序?yàn)椋?4℃4min，94℃20s，55℃20s，72℃30s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖（0.5×TBE）電泳檢測(cè)，BioRad凝膠成像儀觀察，記錄結(jié)果。

1.5 檢測(cè)片段克隆和序列分析

雙生病毒通用引物PCR擴(kuò)增所得的檢測(cè)片段連接pMD 18－T （TaKaRa），轉(zhuǎn)化克隆驗(yàn)證后委托南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。運(yùn)用DNAMAN軟件（Lynnon Biosoft Inc.）對(duì)所獲序列進(jìn)行加工整理和同源性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 福州市朱槿曲葉病危害現(xiàn)狀

通過(guò)與苗圃基地花農(nóng)們座談得知，福州朱槿苗木最初由廣東調(diào)運(yùn)而來(lái)，隨后經(jīng)過(guò)枝條扦插繁殖而擴(kuò)大種植；朱槿疑似曲葉病最早發(fā)生于2009年，當(dāng)時(shí)只有零星苗圃發(fā)生，經(jīng)過(guò)3年時(shí)間已經(jīng)擴(kuò)散至福州市各苗圃基地、多數(shù)綠化帶以及周邊縣市。因此，推測(cè)該病隨苗木調(diào)運(yùn)而傳入福州地區(qū)。福州市朱槿曲葉病發(fā)病癥狀和已報(bào)道的朱槿曲葉病癥狀一致，如封面所示：發(fā)病朱槿植株和枝條都明顯矮化；新葉黃化明顯；葉片畸形，變小，老葉和新葉皆向上卷曲，呈杯狀或勺狀；葉脈增大、明脈或脈突，葉片背面粗糙不平且于葉脈處產(chǎn)生耳突；較大的朱槿病株都能正常開(kāi)花，但花較健康略小，但較小的苗木多數(shù)不能正常開(kāi)花。

2.2 朱槿曲葉病的PCR檢測(cè)和鑒定

應(yīng)用雙生病毒的通用引物（PA／PB）對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，樣品1～12號(hào)都能得到預(yù)期約480bp大小的片段（見(jiàn)圖1）。選擇樣品1～6進(jìn)行測(cè)序，檢測(cè)片段的序列完全一致。在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增DNA－A余下約2260bp片段（以樣品1～6的總DNA為模板，擴(kuò)增結(jié)果如圖1中13～18泳道），并予以測(cè)序。DNA－A全長(zhǎng)序列（GenBank登錄號(hào)：JX861210）分析比較如圖2所示，在引起棉花曲葉病的8種病毒中，檢測(cè)樣品的DNA－A序列與CLCuMV相似性最高，其中與CLCuMV廣東分離物（JX286664）和廣西分離物（JQ317603）的相似性高達(dá)99.6%以上，說(shuō)明引起福州朱槿曲葉病的病原是CLCuMV。

圖1 福州朱槿曲葉病的PCR檢測(cè)及DNA－A的擴(kuò)增Fig.1 PCR detection of leaf curl disease on H.rosa－sinensis plants and PCR amplification of the geminivirus DNA－A

圖2 基于雙生病毒的DNA－A核酸全序列構(gòu)建的親緣關(guān)系樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree based on complete sequence of Begomovirus DNA－A

2.3 煙粉虱生物型鑒定和煙粉虱帶毒率檢測(cè)

煙粉虱生物型鑒定應(yīng)用相應(yīng)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖3所示，用鑒定B型煙粉虱的特異性引物PCR擴(kuò)增能得到預(yù)期的、約480 bp大小的DNA產(chǎn)物（B1～B6），而用鑒定Q型的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，未得到預(yù)期的、約300bp大小的DNA帶條（Q1～Q6），說(shuō)明采集于煙草和健康或發(fā)病朱槿上的煙粉虱生物型是B型。

朱槿病株上煙粉虱的帶毒率應(yīng)用引物PA／PB進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以已經(jīng)鑒定的病株和健株上采集的煙粉虱分別做陽(yáng)性和陰性對(duì)照，結(jié)果如圖4所示。22頭朱槿病株上采集的煙粉虱樣品PCR擴(kuò)增皆能得到預(yù)期的、約480bp大小的DNA條帶，所檢測(cè)的煙粉虱帶毒率100%，說(shuō)明煙粉虱的帶毒效率很高。

3 討論

試驗(yàn)證實(shí)福州市朱槿曲葉病是由CLCuMV侵染引起的。CLCuMV是引起棉花曲葉病的主要病原之一，而棉花曲葉病是棉花生產(chǎn)上最具毀滅性的病毒病害，多次在巴基斯坦、印度、蘇丹、埃及和南非等國(guó)棉花產(chǎn)區(qū)暴發(fā)流行，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［3－4］。已報(bào)道從棉花曲葉病樣中檢測(cè)到8種雙生病毒［3，8］，分別為木爾坦棉花曲葉病毒（CLCuMV）、阿拉巴德棉花曲葉病毒（Cotton leaf curl Alabad virus，CLCuAV）、Kokhran棉花曲葉病毒（Cotton leaf curl Kokhran virus，CLCuKV）、番木瓜曲葉病毒（Papaya leaf curl virus，PaLCuV）、杰濟(jì)拉棉花曲葉病毒（Cotton leaf curl Gezira virus，CLCuGV）、拉賈斯坦棉花曲葉病毒 （Cotton leaf curl Rajasthan virus，CLCuRV）、班加羅爾番茄曲葉病毒 （Tomato leaf curl Bangalore virus，ToLCBV）和布里瓦拉棉花曲葉病毒（Cotton leaf curl Burewala virus，CLCuBuV），這8種病毒在自然條件下由煙粉虱以持久方式傳播，也可以嫁接傳播，不能通過(guò)其他方式傳播，自然寄主包括棉花、黃秋葵、朱槿、垂花懸鈴花和蔟生黃麻等植物［8］。目前，我國(guó)長(zhǎng)江流域、黃河流域和西北內(nèi)陸三大棉花產(chǎn)區(qū)尚未發(fā)現(xiàn)棉花曲葉病毒危害，但在廣東、廣西、海南3省已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CLCuMV危害朱槿、黃秋葵等植物，危害范圍日益擴(kuò)大［7－11］。與廣西情況相似［8］，福建的朱槿苗木最初也是主要來(lái)源于廣東，經(jīng)過(guò)若干年的發(fā)展，朱槿已經(jīng)成為城市公路、公園、工廠、學(xué)校、政府機(jī)關(guān)等常用的綠化植物。由于CLCuMV福州分離物DNA－A與廣東分離物的相似性高達(dá)99.6%以上，推測(cè)CLCuMV可能是通過(guò)朱槿的苗木調(diào)運(yùn)而從廣東省入侵福建省的。入侵后的CLCuMV經(jīng)過(guò)B型煙粉虱在苗圃間傳播，同時(shí)病枝扦插繁殖、苗木交易加速了病毒病的發(fā)生和蔓延擴(kuò)散。更為重要的是，朱槿和棉花同屬錦葵科，且我國(guó)廣西已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有CLCuMV危害棉花的報(bào)道［17］，如果該病毒分離物一旦入侵棉區(qū)，勢(shì)必造成嚴(yán)重后果。此外，試驗(yàn)也驗(yàn)證了福州市朱槿曲葉病病株上煙粉虱的生物型是B型，該生物型是我國(guó)煙粉虱種群中的優(yōu)勢(shì)種，南北多數(shù)省市均有分布，攜帶和傳播棉花曲葉病毒的能力較強(qiáng)。因此有必要在廣東、廣西、海南、福建等省開(kāi)展對(duì)木爾坦棉花曲葉病毒引起的植物病害綜合治理研究，以控制其擴(kuò)散和蔓延，特別要警惕CLCuMV隨煙粉虱傳播、擴(kuò)散至內(nèi)陸棉區(qū)暴發(fā)流行。

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