豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白與豬O型口蹄疫病毒VP1蛋白在桿狀病毒中共表達及鑒定

王一平，郭龍軍，唐青海，劉 丹，危艷武，李勝斌，劉建波，黃立平，吳洪麗，劉長明

(中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/豬傳染病研究室，黑龍江哈爾濱150001)

豬圓環(huán)病毒 2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的主要病原，為單股環(huán)狀DNA病毒，直徑為17nm，基因組約1.7kb[1-2]。PCV2含有兩個主要的開放閱讀框(ORFs)，其中ORF1編碼與病毒復制相關的蛋白Rep和Rep'[3]，ORF2編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白Cap[4]。PCV2-Cap蛋白是病毒的主要免疫保護性抗原，能夠誘導機體產(chǎn)生特異性免疫應答，是研制基因工程亞單位疫苗的理想靶抗原[5]。口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus，F(xiàn)MDV)是感染偶蹄目動物的重要病原，為單股線狀RNA病毒，直徑為20nm～25nm，基因組約8.5kb[6-7]。FMDV衣殼蛋白由VP1、VP2、VP3和VP44種結(jié)構(gòu)蛋白各60個分子組成，其中VP1蛋白包含病毒的主要抗原位點，為病毒的主要免疫原性蛋白，能夠誘導機體產(chǎn)生中和抗體[8-9]。

研究表明，利用重組蛋白研制的亞單位疫苗對PCV2和FMDV感染具有良好的免疫效果，因此研制同時預防這兩種病毒性疫病的二聯(lián)亞單位疫苗具有重要意義。本研究采用桿狀病毒雙表達系統(tǒng)，共表達PCV2-Cap和FMDV-VP1蛋白，為進一步研制PCV2與FMDV二聯(lián)亞單位疫苗奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒、菌株、細胞和主要試劑 轉(zhuǎn)移載體pFastBacTMDual、轉(zhuǎn)染試劑 CellfectinRⅡReagent、E.coli DH10BacTM感受態(tài)細胞和昆蟲細胞株(Sf21)均購自Invitrogen公司；Grace's昆蟲細胞培養(yǎng)基購自GIBCO公司；高保真酶KOD-Plus-Neo購自TOYOBO公司；辣根過氧化物酶標記的葡萄球菌A蛋白(HRP-SPA)購自Zymed公司；DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物科技有限公司；PCV2重組質(zhì)粒pMD18-PCV2a/CL和O型FMDV-VP1基因重組質(zhì)粒pMD18-VP1均由本實驗室構(gòu)建并保存；PCV2和FMDV陽性血清由本研究所相關實驗室提供。

1.2 引物設計與目的基因擴增 根據(jù)pMD18-PCV2a/CL基因序列設計引物，P1-F：5'-ACGCGTCGAC ACCATGGCGTATCCAAGGAGGCGTTTC-3'(SalⅠ)；P1-R：5'-AAAACTGCAGTCAATGGTGATGGTGATG ATGGGGTTTAAGTGGGGGGTCTTT-3'(PstⅠ )。 根據(jù)pMD18-VP1基因序列設計引物，P2-F：5'-CCG CTCGAGACCATGGCCACTTCGACAGGCGAGTCG-3'(XhoⅠ)；P2-F：5'-ACATGCATGCTCAATGGTGAT GGTGATGATGTAAGGACTGCTTTACAGGTGCCAC T-3'(SphⅠ)。P1-F和 P2-F中 5'-ACCATGG-3'為“Kozak”序列。引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。采用高保真酶擴增PCV2-Cap和FMDV-VP1基因，PCR反應程序為：94℃5min；94℃30s、62℃30s、68℃45s，35個循環(huán)；68℃7m in。

1.3 重組轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建及鑒定 將PCV2-Cap和FMDV-VP1基因分別克隆至pFastBacTMDual PPH和PP10啟動子下游多克隆位點MCSⅠ和MCSⅡ處，構(gòu)建單表達PCV2-Cap和FMDV-VP1蛋白的重組轉(zhuǎn)移載體pFBD-PCV2-Cap和pFBD-FMDV-VP1。將FMDVVP1基因克隆至pFBD-PCV2-Cap PP10啟動子MCSⅡ處，構(gòu)建共表達PCV2-Cap與FMDV-VP1蛋白的重組轉(zhuǎn)移載體pFBD-Cap-VP1。經(jīng)PCR、雙酶切及測序鑒定。

1.4 重組桿粒的構(gòu)建及鑒定 將pFBD-PCV2-Cap、pFBD-FMDV-VP1和 pFBD-Cap-VP1分別轉(zhuǎn)化DH10BacTM感受態(tài)細胞，在含有X-gal和IPTG的三抗平板(含卡那霉素、慶大霉素和四環(huán)素)上進行兩輪藍白菌落篩選，構(gòu)建重組桿粒rBacmid-PCV2-Cap、rBacm id-FMDV-VP1和 rBacm id-Cap-VP1。 根據(jù)操作手冊中介紹的方法提取重組桿粒，以M 13通用引物進行PCR鑒定。

1.5 重組桿狀病毒的制備 參照轉(zhuǎn)染試劑說明書，將 rBacmid-PCV2-Cap、rBacm id-FMDV-VP1和 rBacm id-Cap-VP1分別轉(zhuǎn)染對數(shù)生長期的Sf21細胞，培養(yǎng)至出現(xiàn)細胞病變(CPE)，收獲上清，即為P1代重組桿狀病毒(rBac-PCV2-Cap、rBac-FMDV-VP1和rBac-Cap-VP1)，傳代增殖。

1.6 重組蛋白的表達及鑒定 取P3代重組桿狀病毒感染Sf21細胞，27℃培養(yǎng)72h～96h后收獲細胞培養(yǎng)物，經(jīng)SDS-PAGE電泳，薄層掃描測定重組蛋白含量。采用western blot試驗檢測重組蛋白的反應原性：一抗為 PCV2陽性血清(1∶100)和 /或FMDV 陽性血清(1∶200)，二抗為 HRP-SPA(1∶4000)，DAB顯色。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的PCR擴增 PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCV2-Cap與FMDV-VP1基因分別在預期位置出現(xiàn)特異性片段，表明目的基因擴增正確(圖1)。

2.2 重組轉(zhuǎn)移載體的鑒定 pFBD-PCV2-Cap和pFBD-Cap-VP1經(jīng)PCR擴增獲得743bp片段，pFBDFMDV-VP1和pFBD-Cap-VP1經(jīng)PCR擴增獲得685bp片段，分別與PCV2-Cap和FMDV-VP1基因片段大小相符。經(jīng)雙酶切分析，3種重組質(zhì)粒在預期位置均出現(xiàn)特異性條帶，并且測序結(jié)果與預期相符，表明這3種重組轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建正確。

2.3 重組桿粒的PCR鑒定 采用M 13正反向通用引物分別對空桿粒和3種重組桿粒進行PCR擴增，空桿粒擴增部位為m ini-attTn7元件，擴增片段大小約為300bp，重組桿粒擴增部位為Tn7R、Tn7L元件和目的基因，rBacm id-PCV2-Cap、rBacm id-FMDVVP1及rBacm id-Cap-VP1擴增片段大小分別約為3300bp、3200bp和4000bp，與預期片段大小(3293bp、3236bp和3969bp)一致，表明這3種重組桿粒構(gòu)建正確。

2.4 重組蛋白表達的鑒定 SDS-PAGE和western blot檢測結(jié)果表明，單表達的重組PCV2-Cap蛋白產(chǎn)物在28ku處出現(xiàn)特異性條帶，占總蛋白含量的24.6%，可以與PCV2抗體發(fā)生特異性反應(圖2A、B和C)；單表達的重組FMDV-VP1蛋白產(chǎn)物在30ku處出現(xiàn)特異性條帶，占總蛋白含量的5.6%，可以與FMDV抗體產(chǎn)生特異性反應(圖2A、B和D)；共表達的重組PCV2-Cap與FMDV-VP1蛋白產(chǎn)物分別在28ku和30ku處出現(xiàn)兩條特異性條帶，但蛋白表達量有所下降，分別占總蛋白含量的11.6%和3.4%，與PCV2和FMDV抗體均能夠發(fā)生特異性反應(圖2A、B和E)。

3 討論

本研究選用的桿狀病毒雙表達轉(zhuǎn)移載體pFast-BacTMDual包含兩個啟動子，即PPH和PP10啟動子，它們均為晚期基因增強型啟動子，可以同時高效表達兩個外源基因，共表達產(chǎn)物中的兩種蛋白均保持各自獨立的生物活性[10-11]。為提高PCV2-Cap和FMDV-VP1這2種外源蛋白的表達效率，本實驗在設計引物時引入Kozak序列[12]，以期獲得高產(chǎn)的共表達產(chǎn)物。本研究中2種外源基因的表達效率存在差異，根據(jù)其各自占總蛋白的比例顯示，無論單表達或是共表達，PCV2-Cap蛋白的表達效率均顯著高于FMDV-VP1蛋白，這與兩種蛋白編碼基因序列自身性質(zhì)密切相關，但具體原因有待進一步研究。

PCV2-Cap蛋白是PCV2的主要免疫保護性抗原，能夠誘導機體產(chǎn)生中和抗體，為研制PCV2亞單位疫苗的理想靶抗原[5]。FMDV-VP1蛋白是FMDV的主要免疫保護性抗原，能夠誘導機體產(chǎn)生中和抗體，為研制FMDV亞單位疫苗的理想靶抗原[9]。目前，防控PCV2和FMDV的感染和傳播主要采用滅活疫苗，研究表明，采用重組蛋白亞單位疫苗可以有效預防這2種病毒性疾病，研制同時預防這2種疾病的二聯(lián)亞單位疫苗具有重要應用價值。本研究采用桿狀病毒雙表達系統(tǒng)，共表達PCV2-Cap與FMDV-VP1蛋白，并證明共表達產(chǎn)物具有良好的反應原性，已基本滿足作為研制亞單位疫苗的條件。下一步工作將利用單表達的重組PCV2-Cap蛋白、FMDV-VP1蛋白，以及兩者共表達產(chǎn)物制備幾種不同形式的亞單位疫苗，開展豬體免疫攻毒試驗，對其免疫原性進行評價，為PCV2與FMDV二聯(lián)亞單位疫苗的研發(fā)奠定基礎。

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