豬巨細(xì)胞病毒gB基因的原核表達(dá)與間接ELISA檢測(cè)方法的建立

朱月華，劉 捷，白 娟，宋艷華，王先煒，姜 平

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)部動(dòng)物細(xì)菌學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210095)

豬巨細(xì)胞病毒(Porcine cytomegalovirus，PCMV)屬于皰疹病毒科β病毒亞科，可以引起新生仔豬死亡、鼻炎、肺炎和生長(zhǎng)速度減緩。該病毒在世界范圍內(nèi)分布廣泛，血清抗體陽(yáng)性率很高。PCMV抑制宿主的免疫功能和防御機(jī)制，尤其是抑制T細(xì)胞功能，繼發(fā)其他病菌感染。此外，豬被認(rèn)為是異種器官移植的良好供體，PCMV在器官移植中備受關(guān)注[1-3]，非人類(lèi)的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物受體器官中曾檢測(cè)到PCMV[4]。因此，建立一種靈敏、快速的PCMV檢測(cè)方法十分必要。本研究對(duì)PCM的糖蛋白B(gB)進(jìn)行原核表達(dá)作為包被抗原，建立了檢測(cè)PCMV血清抗體的間接ELISA方法，為血清抗體的流行病學(xué)檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試驗(yàn)材料 重組質(zhì)粒pET32a-gB、鼠抗PCMV gB血清、30份PCMV標(biāo)準(zhǔn)陰性血清、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬附紅細(xì)胞體病(M.suis)、副豬嗜血桿菌病(HPs)血清抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備保存；PCMV陽(yáng)性血清由本實(shí)驗(yàn)室采用PCMV接種仔豬制備；豬瘟病毒(CSFV)和豬偽狂犬病病毒(PRV)抗血清來(lái)源于IDEXX ELISA試劑盒；蛋白Marker購(gòu)自Invitrogen公司；ELISA板購(gòu)自JetBiofil公司；酶標(biāo)記葡萄球菌A蛋白(HRP-SPA)購(gòu)自博士德生物工程有限公司；TMB購(gòu)自南京博全生物工程有限公司。

1.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化 將已構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET32a-gB和空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化受體菌BL21內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物按說(shuō)明書(shū)采用His Bind Kit過(guò)柱法純化，通過(guò)western blot對(duì)重組蛋白進(jìn)行鑒定。

1.3 ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化

1.3.1抗原包被濃度和待檢血清最佳稀釋倍數(shù)的確定將純化的PCMV gB蛋白稀釋至終濃度0.1μg/m L、0.2μg/m L、0.4μg/m L、0.6μg/m L、0.8μg/m L 和1.0μg/m L，100μL/孔進(jìn)行包被。一抗設(shè) 1∶50、1∶100、1∶200和1∶4004個(gè)稀釋度做方陣試驗(yàn)確定最佳抗原包被濃度和血清稀釋度。

1.3.2包被時(shí)間的優(yōu)化根據(jù)確定的包被濃度，分別采用4℃過(guò)夜、37℃2h后4℃過(guò)夜、37℃2h進(jìn)行包被，陰、陽(yáng)性血清按照確定的稀釋倍數(shù)進(jìn)行ELISA測(cè)定，比較各組陰、陽(yáng)性血清的OD450nm值和P/N值，選擇適合的包被時(shí)間。

1.3.3封閉條件的優(yōu)化根據(jù)確定的包被濃度和時(shí)間，分別以含5%脫脂乳和含1%BSA的PBST，200μL/孔進(jìn)行封閉，封閉時(shí)間分別為：37℃1h、37℃2h、37℃3h，選擇適合的封閉條件。

1.3.4待檢血清作用時(shí)間的優(yōu)化酶標(biāo)板按照選擇的條件包被、封閉后，加入陰、陽(yáng)性血清，37℃分別作用0.5h、1h、1.5h，常規(guī)方法檢測(cè)，選擇適合的血清作用時(shí)間。

1.3.5酶標(biāo)抗體工作濃度的優(yōu)化待檢血清按照確定的時(shí)間作用后，將酶標(biāo)抗體分別進(jìn)行1∶10000、1∶15000、1∶20000稀釋?zhuān)?00μL/孔，常規(guī)方法檢測(cè)，選擇適合的酶標(biāo)抗體工作濃度。

1.3.6酶標(biāo)抗體作用時(shí)間的優(yōu)化將酶標(biāo)抗體按照確定的稀釋倍數(shù)加入酶標(biāo)板后，37℃分別作用0.5h、1h、1.5h，常規(guī)方法進(jìn)行ELISA測(cè)定，選擇適合的酶標(biāo)抗體工作濃度。

1.4 臨界值的確定 取30份PCMV陰性豬血清，按照已建立的檢測(cè)方法進(jìn)行ELISA測(cè)定，將得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，得到OD450nm平均值X和標(biāo)準(zhǔn)差SD。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，OD450nm≥X+3SD時(shí)，判為陽(yáng)性。OD450nm≤X+2SD時(shí)，判為陰性，介于二者之間者判為可疑。

1.5 特異性試驗(yàn) 按照建立的檢測(cè)方法，分別對(duì)CSFV、PRRSV、PRV、HPs、PCV2和M.suis陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，每份血清重復(fù)檢測(cè)兩個(gè)孔，根據(jù)S/P值判定其特異性。

1.6 敏感性試驗(yàn) 選取8份不同的PCMV gB陽(yáng)性血清和一份陰性血清，在稀釋100倍的基礎(chǔ)上分別進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)瑱z測(cè)所建立方法的敏感性。

1.7 重復(fù)性試驗(yàn)

1.7.1批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)采用同一批次制備的抗原包被ELISA板，取5份不同抗體水平的陽(yáng)性血清和一份標(biāo)準(zhǔn)陰性血清，在同一批試驗(yàn)中進(jìn)行ELISA測(cè)定，每份血清平行做5孔，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.7.2批間重復(fù)試驗(yàn)采用不同時(shí)間制備的3批蛋白包被ELISA板，取5份不同抗體水平的陽(yáng)性血清和1份陰性血清進(jìn)行ELISA測(cè)定，每份血清平行做2孔，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.8 臨床血清樣品檢測(cè) 采用本實(shí)驗(yàn)建立的間接ELISA方法對(duì)2011年～2012年江蘇省259份仔豬血清進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 重組蛋白的原核表達(dá)、純化和鑒定 重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白gB，純化后可見(jiàn)一條39ku的目的蛋白條帶(圖1A)。Western blot鑒定結(jié)果顯示，該蛋白具有PCVM抗原特性(圖1B)。

2.2 間接ELISA工作條件的優(yōu)化 經(jīng)過(guò)優(yōu)化確定的最佳抗原包被量為0.4μg/m L；待檢血清稀釋度1∶100；包被時(shí)間為37℃作用2h；然后4℃過(guò)夜；5%脫脂乳37℃封閉2h；血清作用時(shí)間為1h；二抗1∶10000稀釋?zhuān)?7℃作用2h。

2.3 臨界值的確定 取30份陰性血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：OD450nm最高值為0.316、最低值為0.073，其平均值為0.177，標(biāo)準(zhǔn)偏差SD為0.0589，因此陽(yáng)性樣品檢測(cè)下限為+3SD=0.354。為了減少假陽(yáng)性和假陰性血清出現(xiàn)的概率，將臨界值加減一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差設(shè)為可疑區(qū)，即當(dāng)OD450nm≥0.354時(shí)判為陽(yáng)性；當(dāng) OD450nm≤+2SD即 OD450nm≤0.295時(shí)判為陰性，介于兩者之間判為可疑。

2.4 特異性試驗(yàn) 檢測(cè)結(jié)果顯示除PCMV陽(yáng)性血清檢測(cè)為陽(yáng)性外，其他6種豬病毒陽(yáng)性血清及PCMV陰性血清均為陰性反應(yīng)，表明該方法特異性較高。

2.5 敏感性試驗(yàn) 采用6份PCMV陽(yáng)性血清做滴度稀釋后進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，當(dāng)血清稀釋度達(dá)到1∶3200時(shí)，6份陽(yáng)性血清的S/P值仍大于0.354，表明該方法敏感性較好(表1)。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 間接ELISA重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)為2.9%～9.2%，批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)為2.9%～9.9%，均小于10%(表2)，表明該ELISA方法重復(fù)性較好。2.7臨床血清樣品的檢測(cè) 采用建立的間接ELISA方法對(duì)來(lái)自江蘇省259份送檢血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示這些地區(qū)送檢血清的PCMV抗體陽(yáng)性率為21.27%～91.67%，陽(yáng)性率為57.76%，其中南京和南通地區(qū)豬血清抗體檢出率為27.27%～36.36%，揚(yáng)州和沭陽(yáng)市血清抗體陽(yáng)性率較高，達(dá)70%以上(表3)，表明江蘇省豬場(chǎng)PCMV感染比較普遍。

表1 ELISA方法敏感性試驗(yàn)結(jié)果Table 1The sensitivity test of the ELISA

表2 間接ELISA批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)和批間重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果Table 2Intra-assay and inter-assay reproducibility test of the indirect ELISA

表3 江蘇省不同地區(qū)仔豬血清樣品間接ELISA檢測(cè)結(jié)果Table 3Result of detecting serum samples of pigs from Jiangsu province by indirect ELISA

3 討論

PCMV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法主要有PCR[5-6]、熒光定量PCR方法[7]、免疫組織化學(xué)方法等[8]和ELISA抗體檢測(cè)方法[3]，其中前3種方法用于檢測(cè)病毒基因和發(fā)病豬組織中病毒抗原。Yoo等報(bào)道采用PCMV全病毒為抗原，建立了間接ELISA方法，可以用于檢測(cè)PCMV抗體[3]。但目前，我國(guó)尚無(wú)商品化PCMV抗體檢測(cè)試劑盒可供臨床使用。本研究采用重組gB蛋白，經(jīng)過(guò)反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立PCMV間接ELISA抗體檢測(cè)方法，具有簡(jiǎn)單、快速、敏感和特異等優(yōu)點(diǎn)，可以用于PCMV抗體檢測(cè)和流行病學(xué)研究。

ELISA抗原是建立該方法的關(guān)鍵試劑之一。PCMV基因結(jié)構(gòu)與功能比較復(fù)雜，目前已經(jīng)有報(bào)道的病毒基因主要包括DNA聚合酶、核衣殼蛋白和囊膜糖蛋白(gB)等[8-10]，其中，gB蛋白為該病毒復(fù)制的必需結(jié)構(gòu)蛋白，具有較好的免疫原性，可以誘導(dǎo)豬體產(chǎn)生中和抗體，具有免疫保護(hù)作用[11-12]。因此，本研究選擇gB蛋白作為ELISA抗原。為了提高該方法的特異性和敏感性，我們采用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的大腸桿菌表達(dá)的gB蛋白，經(jīng)過(guò)親和層析方法純化獲得純度較高的重組蛋白，包被濃度僅為0.4μg/m L，使用效果較好。

PCMV標(biāo)準(zhǔn)陰、陽(yáng)性血清是確定該方法判定標(biāo)準(zhǔn)的重要試劑，但由于該標(biāo)準(zhǔn)血清購(gòu)置存在困難，本項(xiàng)目前期研究采用PCMV人工感染仔豬，制備獲得PCMV血清為陽(yáng)性血清，同時(shí)以健康清潔級(jí)仔豬制備獲得血清作為PCMV陰性血清。在此基礎(chǔ)上，我們?cè)俨捎脙?yōu)化的ELISA反應(yīng)條件，選擇30份PCMV陰性血清，測(cè)定OD450nm值，計(jì)算平均值X和SD值，OD450nm≥X+3SD為陽(yáng)性，OD450nm≤X+2SD為陰性，介于兩者之間判為可疑，從而確定了該方法PCMV陰陽(yáng)性血清判定條件。

當(dāng)然，由于沒(méi)有商品化試劑盒，該方法與其它抗體檢測(cè)方法符合率試驗(yàn)尚不能進(jìn)行。此外，259份臨床血清樣品檢測(cè)結(jié)果初步表明，江蘇省規(guī)模豬場(chǎng)PCMV平均抗體陽(yáng)性率為57.76%，應(yīng)引起關(guān)注。

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