金黃色葡萄球菌毒力因子PSM-α的4個基因串聯(lián)融合表達及其對人中性粒細胞的生物學(xué)作用

劉麗慧，溫 峻，袁 鵬，史祺云，金琨琪，程 威，于 錄*，馮海華*

(1.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林長春130062；2.吉林大學(xué)人獸共患病研究所人獸共患病研究教育部重點實驗室，吉林長春130062)

金黃色葡萄球菌(S.aureus)是人類常見的病原菌，感染后可以引起肺炎、心內(nèi)膜炎、骨髓炎甚至敗血癥[1]。由于抗生素濫用，S.aureus對多種抗生素產(chǎn)生了耐藥性[2]。特別是近年來出現(xiàn)的社區(qū)獲得性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(CA-MRSA)[3-4]，因其直接或間接的與健康醫(yī)療設(shè)施相關(guān)，已成為最重要的公共衛(wèi)生問題之一[5]。

酚可溶性調(diào)控蛋白(Phenol-soluble modulin，PSM)是最新發(fā)現(xiàn)的一種細胞外分泌蛋白，它在不需受體介導(dǎo)的條件下即具有細胞裂解能力，是逃避中性粒細胞的重要毒力因子；PSM還具有趨化功能，并能夠誘導(dǎo)中性粒細胞釋放細胞因子，引發(fā)炎癥反應(yīng)[6-7]。PSM由核基因編碼并且基因成簇存在，可分為 α-肽(-20～25個氨基酸)和 β-肽(-45個氨基酸)，具有兩親性 α-螺旋結(jié)構(gòu)。其中，α-肽包括PSM-α1、PSM-α2、PSM-α3和 PSM-α44種 亞 型 ，β-肽由β1和β2組成。David等研究表明，當(dāng)敲除PSM-α后，S.aureus的致病力明顯降低，而敲除PSM-β后未見致病力的明顯變化[8]，表明PSM-α是S.aureus致病的主要毒力因子。本實驗串聯(lián)融合表達PSM-α蛋白，采用純化的蛋白刺激健康人的中性粒細胞，通過ELISA檢測IL-1β及IL-8的含量，鑒定其對中性粒細胞的影響，為制備抗體及為S.aureus感染的有效控制和臨床治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要實驗材料 大腸桿菌BL21(DE3)及表達載體pGEX-4T-1均為本實驗室保存；限制性內(nèi)切酶SalⅠ、Bam HⅠ及T4連接酶均購自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒及DNA片段純化回收試劑盒購自Axygen；還原型谷胱甘肽(GSH)購自上海鼎國生物技術(shù)有限公司；人中性粒細胞分離液Polymorphprep購自AXIS-SHIELD PoC AS；純化柱及 Glutathione Sepharose 4B購自GE公司；凝血酶購自生工生物工程(上海)有限公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所；小鼠抗谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)抗體購自長春寶泰克生物科技公司；過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠抗體、Hepes緩沖液均購自武漢博士德生物工程有限公司；ELISA試劑盒購自e-Bioscience。

1.2 表達重組質(zhì)粒pGEX-PSM-α的構(gòu)建 根據(jù)GenBank中登錄的PSM-基因序列(BK006301.1)，通過 linker將 PSM-α1、PSM-α2、PSM-α3、PSM-α44個基因(圖1)串聯(lián)于pUC-50T載體中(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成)，SalⅠ及Bam HⅠ雙酶切目的片段，經(jīng)DNA純化回收試劑盒回收目的片段，連接表達載體pGEX-4T-1，轉(zhuǎn)化感受態(tài)BL21(DE3)。培養(yǎng)后，提取重組質(zhì)粒雙酶切鑒定并測序鑒定。

1.3 PSM-α蛋白表達條件優(yōu)化及鑒定 將重組菌37℃培養(yǎng)至OD600nm值為0.4～0.6，分別加入0.2mM～1mM IPTG，誘導(dǎo)溫度分別為16℃～37℃，轉(zhuǎn)數(shù)分別為180r/min～220r/m in，誘導(dǎo)時間分別為2h～12h，經(jīng)SDS-PAGE分析確定最佳誘導(dǎo)條件。以優(yōu)化條件大量誘導(dǎo)表達蛋白，收集菌體并超聲裂解，離心后將收集沉淀及上清分別進行SDS-PAGE及western blot鑒定。

1.4 PSM-α蛋白純化、酶切及SDS-PAGE鑒定按照Glutathione Sepharose 4B Affinity操作說明書純化表達蛋白、凝血酶酶切(切除GST標(biāo)簽)，獲得的蛋白分別進行SDS-PAGE鑒定。

1.5 人中性粒細胞的分離 按照Polymorphprep說明書分離健康人外周靜脈血(EDTA-K2抗凝處理)中性粒細胞，重懸于RPM I-1640培養(yǎng)基中。

1.6 細胞毒性檢測 將分離的中性粒細胞按1×104cells/孔培養(yǎng)于96孔板中，實驗組中加入純化后酶切處理的重組蛋白，使其終濃度分別為10μg/m L、1μg/m L、100ng/m L、10ng/m L，同時設(shè)置空白孔及陰性對照孔，分別培養(yǎng) 2h、4h、6h，根據(jù)CCK-8操作說明書測定不同濃度蛋白對細胞存活率的影響，計算公式為：細胞存活率(%)=(實驗組A均值-空白孔A值)/(對照孔A值－空白孔A均值)×100%。

1.7 ELISA檢測 將分離的中性粒細胞按1.5×105cells/孔培養(yǎng)于96孔板中，實驗組加入純化后酶切處理蛋白，使其終濃度為10μg/m L，置于37℃5%CO2培養(yǎng)6h[9]，收集上清，通過ELISA檢測IL-1β及 IL-8的含量(e-Bioscience)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0對實驗所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 pGEX-PSM-α表達重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定通過人工合成由linker連接編碼PSM-α4個基因(PSM-α1、PSM-α2、PSM-α3、PSM-α4)的串聯(lián)融合基因，并克隆于pGEX-4T-1載體中，構(gòu)建表達重組質(zhì)粒pGEX-PSM-α，經(jīng)SalⅠ及Bam HⅠ雙酶切后，得到306bp目的片段(圖2)，測序結(jié)果與預(yù)期相符。

2.2 PSM-α 蛋白 SDS-PAGE及 western blot鑒定 用不同誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)表達蛋白，超聲裂解離心后收集沉淀及上清，經(jīng)western blot試驗表明其具有免疫原性(圖 3)。以優(yōu)化條件 1mM IPTG，16℃220r/m in誘導(dǎo)12h，大量表達分子量為36ku的可溶性蛋白。

2.3 PSM-α蛋白純化及酶切結(jié)果 誘導(dǎo)表達后蛋白經(jīng)Glutathione Sepharose 4B親和層析柱純化得到36ku的蛋白，純化后蛋白經(jīng)凝血酶切除GST標(biāo)簽后得到10ku重組蛋白(圖4)。

2.4 細胞毒性檢測結(jié)果 用純化后酶切處理的PSM-α蛋白作用于分離的中性粒細胞，通過CCK-8試劑盒檢測不同蛋白濃度、不同作用時間對細胞存活率的影響(圖5)，結(jié)果表明當(dāng)?shù)鞍诐舛葹?0μg/m L、作用6h后，對細胞的毒性為10%(將該濃度作為該蛋白對細胞的基本無毒濃度)。

2.5 ELISA檢測結(jié)果 采用ELISA方法檢測IL-1β及IL-8，結(jié)果表明PSM-α蛋白刺激中性粒細胞后，空白組IL-8僅為74pg/m L，實驗組IL-8含量平均為918pg/m L，差異極顯著(p<0.01)；對照組 IL-1β(16pg/m L)與實驗組(45pg/m L)相比差異不顯著。

3 討 論

PSM-α是CA-MRSA的毒力因子之一，已有報道表皮葡萄球菌能夠引起巨噬細胞系中一些細胞發(fā)生炎癥反應(yīng)[10]。有研究表明，CA-MRSA野生株與PSM-α敲除株相比，其毒力及致病性明顯降低[11]。本實驗從S.aureus致病的主要毒力因子入手，串聯(lián)融合表達了PSM-α。純化后的蛋白可以通過免疫動物獲得特異性抗體，為預(yù)防S.aureus感染提供依據(jù)。此外，研究PSM-α對中性粒細胞的作用，可以從根本上對S.aureus的感染進行控制及治療。

中性粒細胞是最先滲入組織中的白血球，它們通過趨化因子的梯度漸變而隨血流到達感染部位，是清除細菌最重要的吞噬細胞[11]，也是天然免疫不可或缺的一部分。在炎癥及敗血型休克中，TNF-α、IL-1β以及IL-6是主要炎性因子，而TNF-α、IL-8是中性粒細胞強烈的化學(xué)引誘物[12]。有研究表明，PSM-α的致病機理是破壞白細胞，因此，在S.aureus逃避宿主天然免疫中PSM-α起到關(guān)鍵作用[6]。本研究通過PSM-α蛋白刺激人的中性粒細胞后，檢測兩種細胞因子的含量顯示，IL-8表達量升高，提示PSM-α是通過趨化中性粒細胞從血循環(huán)到感染或組織損傷部位而引發(fā)機體的炎癥反應(yīng)。

本研究結(jié)果表明，PSM-α能夠刺激中性粒細胞釋放炎性趨化因子，致使機體發(fā)生炎癥，該實驗為更好的控制S.aureus的感染和提高臨床治療效果提供一定的依據(jù)。

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