靶向O型口蹄疫病毒shRNA轉基因豬體細胞抗病毒活性研究

蔡擴軍，馬鈰委，喬 軍，孟慶玲，陳創(chuàng)夫，黃 炯，張再超，楊海波

(1.石河子大學動物科技學院，新疆石河子832003；2.新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所，新疆烏魯木齊830000)

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是由FMD病毒(FMDV)引起的牛、羊、豬等偶蹄類動物的一種急性、熱性、高度接觸傳染性動物疫病[1]。該病傳播速度快，宿主范圍廣，傳播途徑多，發(fā)病率高，對偶蹄類動物的危害嚴重。OIE將其列為必須實時通報動物疫病之一；我國將其列為一類動物傳染病[2]。國內主要采用滅活疫苗免疫和撲殺相結合的防控措施，但該病仍然時有發(fā)生。因此，采取更有效的措施控制FMD疫情的發(fā)生和蔓延，已成為目前亟待研究的重要課題。

干擾RNA(RNA interference，RNAi)是通過一段短雙鏈RNA分子引起具有相同序列的mRNA發(fā)生降解來關閉相應的基因表達的過程[3-4]。RNAi效應具有快速和高度特異性的特征。目前已知在昆蟲和植物細胞中RNAi是其主要的抗病毒機制，但哺乳動物細胞感染病毒后幾乎沒有發(fā)現(xiàn)能自發(fā)誘導有效的抗病毒RNAi反應[5]。因此，人們一直在探索能夠利用人工方法在哺乳動物細胞中建立有效的抗病毒RNAi防御策略。本實驗室已通過轉基因克隆相關技術培育了靶向FMDV的VP1基因的shRNA轉基因豬。本實驗對基因豬的體細胞水平進行抗病毒活性檢測，評價其抗病毒活性，為進一步在動物個體水平上抗病毒活性的檢測奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 靶向O型FMDV轉基因克隆豬(大白)由本項目組培育；O型FMDV OS/99株、豬抗O型FMDV的陽性血清由新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所提供；細胞基因組提取試劑盒、RNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；M icroRNA檢測試劑盒購自Gene Copoeia公司；SYBR Green I購自TaKaRa公司；TRIzol和DMEM培養(yǎng)基購自Invitrogen公司；DNA酶I、反轉錄試劑盒 Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit購自Fermentas公司；標記和檢測系統(tǒng)DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit購自Roche公司；FITC標記的Protein A protein(FITC-SPA)購自Abcam公司。

1.2 引物設計及合成 采用分子生物學軟件Primer 5.0設計siRNA、仔豬的內參基因HMBS[6](DQ845174)和O型FMDV VP1基因(HQ116289)特異性引物。siRNA上游引物：5'-GCCAAGAGGACAAAGCGCT G-3'；通用下游引物由GeneCopoeia公司提供。HMBS上游引物：5'-AGGATGGGCAACTCTACCTG-3'；下游引物 5'-GATGGTGGCCTGCATAGTCT-3'。VP1上游引物：5'-TCAAGCCAAAGGAACAAGT-3'；下游引物：5'-TAGACGGTCGCTAAGACAC-3'。外源基因鑒定上游引物：5'-GAAGATCTCCCAGTGGAAAG-3'；下游引物5'-CGGAATTCTTGGAAAAAAGCTACAGA TCACC-3'，由華大生物科技有限公司合成。

1.3 轉基因豬體細胞的制備及基因組DNA的PCR及southern blot鑒定 取同一品種、同為1日齡的轉基因豬(4頭)和非轉基因豬(1頭)耳尖，按照組織塊消化法制備體細胞進行細胞培養(yǎng)。按照細胞基因組提取試劑盒操作說明書分別提取轉基因豬和非轉基因豬體細胞的基因組DNA。采用外源基因鑒定引物進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，將目的片段從凝膠中回收純化并由華大基因公司進行測序。采用EcoRⅠ和KpnⅠ消化約25μg基因組DNA，酶切產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離后轉移至Hybond+尼龍膜，利用外源基因鑒定引物PCR擴增回收片段為探針，按ECL直接核酸標記及檢測系統(tǒng)說明書進行southern blot鑒定。陽性、陰性對照分別為同時用EcoRⅠ、KpnⅠ雙酶切的shRNA重組質粒和非轉基因豬體細胞的基因組。

1.4 病毒感染試驗 分別將制備的4頭轉基因和1頭非轉基因豬的體細胞培養(yǎng)于6孔細胞培養(yǎng)板，在P3實驗室進行病毒感染試驗。以10TCID50FMDV感染細胞16h后，以豬抗O型FMDV陽性血清為一抗、FITC-SPA為二抗，參照文獻[7]的方法進行間接免疫熒光試驗(IFA)。

1.5 感染FMDV豬體細胞中病毒載量的檢測 構建pMD-VP1和pMD-HMBS重組質粒，并將pMD-VP1和pMD-HMBS按1∶10梯度稀釋，各建立6個梯度，利用拷貝數(shù)和CT值做標準曲線。以10TCID50FMDV感染細胞12h、24h、36h、48h后，將孔內的感染細胞及培養(yǎng)液反復凍融3次，分別用TRIzol提取各孔病毒細胞液的總RNA，按照反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄反應。按照SYBR Green I熒光定量PCR試劑盒說明書進行熒光定量PCR檢測。PCR反應體積為25μL。擴增條件為：95℃30s；95℃ 10s、59℃ 30s、72℃ 30s，40個循環(huán)；72℃10s。在延伸階段檢測熒光強度，收集信號。在相同條件下與待測樣品同時進行熒光定量PCR反應，同時擴增HMBS內參基因，根據(jù)HMBS拷貝數(shù)值采用最大二階導數(shù)法(2-ΔΔCt)進行統(tǒng)計學分析[8]。同時應用SPSS17.0統(tǒng)計學分析軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1 轉基因豬體細胞的制備及基因組DNA的PCR及southern blot鑒定 制備的體細胞形態(tài)正常，生長狀況良好(圖1)。1、2、4、9號轉基因克隆仔豬耳組織基因組DNA PCR擴增出402bp的目的條帶，而同日齡的非轉基因豬體細胞基因組DNA沒有擴增出目的條帶(圖2)，同時測序結果和Southern blot試驗結果也證明轉基因克隆仔豬基因組DNA中攜帶有靶向FMDV VP1基因的shRNA基因片段(圖3)。

2.2 FMDV的細胞感染試驗 非轉基因豬體細胞在攻毒后約8h開始病變，而轉基因豬體細胞在攻毒后約12h開始病變。攻毒后36h觀察CPE，轉基因豬體細胞和非轉基因豬體細胞CPE出現(xiàn)明顯的差異。在攻毒后48h，兩者80%～90%的細胞均變圓，部分細胞脫落，差異不明顯。IFA試驗結果顯示，轉基因豬體細胞的熒光強度比非轉基因豬體細胞的熒光弱，表明FMDV在轉基因豬體細胞內的增殖量比在非轉基因豬體細胞要少(圖4)。CPE觀察結果和IFA結果均表明轉基因克隆仔豬體細胞具有一定抑制FMDV復制的能力。

2.3 感染FMDV體細胞VP1基因RNA相對拷貝數(shù)的檢測結果 經(jīng)Roche Light Cycle@480軟件分析，pMD-VP1和pMD-HMBS的擴增其Error值趨于0，擴增結果具有良好的線性關系，檢測數(shù)據(jù)具有高度的相關性，其中VP1和HMBS的擴增效率接近2。經(jīng)數(shù)據(jù)分析表明，各組VP1基因的初始拷貝數(shù)，經(jīng)內參基因校正，根據(jù)2-ΔΔCt法計算出各個樣本的VP1基因RNA相對拷貝數(shù)，應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件t檢驗。結果顯示：攻毒后，shRNA轉基因豬體細胞對VP1基因的復制具有不同程度的抑制作用，4頭轉基因豬之間差異不顯著(p>0.05)。其中攻毒12h、24h、48h實驗組分別與對照組比較差異不顯著，攻毒后36h實驗組與對照組比較，4頭轉基因豬的平均抑制效率為53.6%，差異顯著(p<0.05)。表明體細胞在攻毒48h內可以抑制VP1基因的表達，其中以攻毒后36h的抑制效果尤為顯著(圖5)。

3 討論

FMDV屬于小RNA病毒科、口蹄疫病毒屬，為單股正鏈RNA病毒，全長約8.5kb，可直接作為信使RNA，是理想的siRNA靶標，適于進行RNAi的研究[9]。研究表明，RNAi是一種抑制FMDV的有效手段[10-13]。將siRNA技術和轉基因技術相結合產(chǎn)生的RNAi轉基因動物具有的穩(wěn)定性、可傳遞性、高效性等優(yōu)勢，突破了RNAi只在細胞水平發(fā)揮作用的局限，提高動物群體的整體抗病毒能力，具有應用前景的防控手段。

目前，轉基因動物主要分別從DNA、轉錄、翻譯和整體表型的水平進行檢測和評價[14-16]。其中DNA水平的檢測包括PCR技術檢測、Southern blot檢測、DNA拷貝數(shù)的檢測、整合位點的檢測；RNA水平的檢測主要包括northern印跡雜交、逆轉錄PCR和RNA斑點雜交等；翻譯水平的檢測包括western blot和酶聯(lián)免疫吸附法；整體水平的觀察對轉基因動物而言主要遵從實質等同性原則，即轉基因動物除表現(xiàn)出外源基因表達蛋白的性狀外，其他生物學特性都要與受體動物相同。但目前為止，國內外對通過RNAi術產(chǎn)生的轉基因動物的檢測手段研究有限，未形成統(tǒng)一的標準。

本研究在成功培育轉基因克隆豬的基礎上，選擇了合適的檢測方法對靶向O型FMDV shRNA轉基因豬體細胞進行抗病毒活性的檢測和評價。首先制備并培養(yǎng)了轉基因豬體細胞，對細胞的基因組DNA進行了PCR和Southern blot鑒定，然后進行了FMDV感染細胞試驗，觀察不同時間點的CPE，IFA檢測了FMDV在轉基因和非轉基因豬細胞內的含量，并通過熒光定量PCR檢測了FMDV在轉基因豬體細胞的復制水平。結果表明：與非轉基因豬體細胞相比，轉基因豬體細胞在攻毒后出現(xiàn)CPE的時間延遲，病變減輕，熒光量明顯的減少，在攻毒后36h時，細胞中FMDV基因組RNA相對拷貝數(shù)顯著降低，表明FMDV在轉基因豬體細胞內的增殖水平要低于非轉基因豬體細胞，顯示轉基因豬體細胞具有一定的抗FMDV的活性。

盡管shRNA轉基因動物體細胞抗病毒能力有限，但可以提供早期對病毒復制的抑制作用。體外抗病毒活性在一定程度上可初步反映機體抗病毒能力，但體外與體內還存在一定的差別，為了解轉基因豬抵抗FMDV能力還要進一步對豬進行攻毒試驗，以便在動物個體上評價靶向FMDV shRNA轉基因豬體抗病毒活性。

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