豬偽狂犬病病毒新流行株的分離鑒定及抗原差異性分析

彭金美，安同慶，趙鴻遠(yuǎn)，劉益民，陳家锃，冷超糧，孫 艷，常 丹，田志軍*，童光志

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/豬病研究室，黑龍江哈爾濱150001；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241)

豬偽狂犬病(Pseudorabies，PR)是由 PR病毒(PRV)引起的一種豬急性傳染病。PRV可以感染不同年齡段的豬，但以妊娠母豬和哺乳仔豬感染最為嚴(yán)重：導(dǎo)致妊娠母豬流產(chǎn)、死胎和木乃伊胎；哺乳仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀、麻痹、衰竭死亡，死亡率幾乎高達(dá)100%。在規(guī)?；i場(chǎng)，一般采用PRV基因缺失疫苗進(jìn)行防制。雖然偶爾有病毒分離的報(bào)道[1-3]，但總體而言該病得到了有效的控制。但2011年以來(lái)，許多使用基因缺失活疫苗免疫的規(guī)?；i場(chǎng)出現(xiàn)了疑似PR流行，主要表現(xiàn)為豬群gE抗體陽(yáng)性率顯著升高，母豬產(chǎn)弱仔、死胎，仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀及死亡等。本研究對(duì)從部分省份的14個(gè)PR免疫豬場(chǎng)送檢的153份臨床樣品進(jìn)行PRV野毒的分離鑒定、gE基因序列分析及血清中和試驗(yàn)，結(jié)果初步表明這些豬場(chǎng)流行的PRV野毒具有某種程度的抗原變異。

1 材料和方法

1.1 病毒株及病料 PRV Bartha k61疫苗株和PRV經(jīng)典強(qiáng)毒雙城株(PRV-S)為本實(shí)驗(yàn)室保存。疑似PR發(fā)病豬腦組織153份，分別來(lái)自于黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙、河南等5個(gè)省14個(gè)免疫PRV Bartha k61弱毒疫苗的豬場(chǎng)。取適量組織進(jìn)行勻漿，勻漿液一部分用于提取病毒基因組DNA做PCR鑒定，一部分用于病毒分離鑒定。

1.2 細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Vero細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存；BALB/c小鼠和實(shí)驗(yàn)豬購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank中登錄的PRV基因組序列(NC_006151)分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增部分gE基因的檢測(cè)引物(gEup1：5'-GCCTGCCACCCGGACC TGGT-3'； gELow1： 5'-CACGTACAGCCCCGACTCG TCC-3')和用于gE全基因擴(kuò)增和序列分析的引物(gEup2：5'-ATGCGGCCCTTTCTG-3'；gELow2：5'-C GGTTCTCCCGGTATTTAAGC-3')。

1.4 病毒基因組的提取及PCR擴(kuò)增 參照文獻(xiàn)[4]的方法進(jìn)行操作。

1.5 病毒分離 將PCR鑒定為陽(yáng)性的腦組織勻漿液，采用0.22μm濾器過(guò)濾除菌后，取1m L接種Vero單層細(xì)胞，孵育1h后更換含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，逐日觀察細(xì)胞病變(CPE)。待70%左右的細(xì)胞出現(xiàn)CPE時(shí)收毒，凍融一次后，連續(xù)在Vero細(xì)胞中傳代擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.6 病毒粒子的電鏡觀察 取Vero細(xì)胞中培養(yǎng)的第5代病毒液用2%磷鎢酸負(fù)染，在電鏡下觀察病毒粒子形態(tài)。

1.7 小鼠感染試驗(yàn) 6周齡～8周齡BALB/c小鼠65只，30只接種10×倍比稀釋(101～106)的 F5代分離毒，30只接種10×倍比稀釋(101～106)的PRV-S強(qiáng)毒株，每個(gè)稀釋度5只、每只經(jīng)腹股溝皮下接種0.1m L，并設(shè)5只小鼠注射等體積DMEM培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照。觀察小鼠臨床癥狀及死亡情況并按Reed-Muench法計(jì)算其LD50。

1.8 病毒中和試驗(yàn) 采用固定病毒稀釋血清法測(cè)定疫苗株Bartha k61接種豬血清和新分離病毒接種豬血清對(duì)兩株病毒(Bartha k61和新分離病毒)的中和抗體效價(jià)，操作過(guò)程參照文獻(xiàn)[5]的方法。抗血清制備：10頭40日齡PRV陰性仔豬，其中5頭肌注1m L含107.0TCID50的新分離PRV，5頭肌注1m L含107.0TCID50的PRV Bartha k61株，每周采血分離血清，56℃滅活30min，病毒量為100TCID50/孔。

2 結(jié) 果

2.1 病料檢測(cè) 將疑似PR發(fā)病豬場(chǎng)病料中的腦組織進(jìn)行勻漿，提取總DNA，以其為模板利用PRV gE特異性引物(gEup1/gELow1)進(jìn)行PCR檢測(cè)。結(jié)果表明從黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙、河南5省14個(gè)豬場(chǎng)中檢測(cè)到87份陽(yáng)性病料，各豬場(chǎng)均存在野毒感染。圖1為其中一個(gè)豬場(chǎng)的檢測(cè)結(jié)果。

2.2病毒的分離及鑒定 將部分陽(yáng)性腦組織勻漿液過(guò)濾除菌后接種Vero細(xì)胞，48h后即可以觀察到網(wǎng)狀的CPE(圖2)。利用gEup1/gELow1對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行PCR鑒定，能夠擴(kuò)增到預(yù)期大小的片段，而利用豬瘟、豬圓環(huán)病毒以及豬繁殖與呼吸綜合征病毒特異性引物[6]擴(kuò)增均呈陰性反應(yīng)。將F5代培養(yǎng)物負(fù)染后進(jìn)行電鏡檢測(cè)，可以觀察到病毒粒子呈圓形，有中空和實(shí)心兩種特征，有的有囊膜有的無(wú)囊膜(圖3)。將其中一分離病毒命名為PRV HeN1。對(duì) BALB/c小鼠的 LD50為 102.37TCID50，PRV-S對(duì)BALB/c小鼠的LD50為103.83TCID50。注射DMEM培養(yǎng)液的對(duì)照鼠無(wú)任何臨床癥狀。

2.3 gE基因序列分析 采用gEup2/gELow2引物，以提取的陽(yáng)性病料組織和細(xì)胞培養(yǎng)物的DNA為模板，擴(kuò)增完整的gE基因編碼區(qū)，克隆于pMD18-T載體中進(jìn)行測(cè)序。利用生物學(xué)軟件DNAStar 6.24對(duì)PRV gE核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)室最近分離的PRV均位于一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的分支中，與以前分離的病毒株親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)(圖4)。

2.4 小鼠感染試驗(yàn) BALB/c小鼠接種PRV HeN1株和PRV-S株后均出現(xiàn)了典型的PR癥狀：發(fā)病鼠撕咬接種部位，導(dǎo)致局部被毛脫落、皮膚出血、嚴(yán)重者后肢被咬斷，接種病毒量在103.0～106.0TCID50的小鼠在接種后72h內(nèi)死亡。通過(guò)計(jì)算PRV HeN1

2.5 血清交叉中和試驗(yàn) 利用中和試驗(yàn)測(cè)定了PRV Bartha k61和HeN1接種豬在不同時(shí)間點(diǎn)采集的血清對(duì)Bartha k61和HeN1病毒的中和能力。結(jié)果表明，Bartha k61接種豬產(chǎn)生的中和抗體水平與HeN1接種豬相比普遍較低，能夠50%中和自身病毒的血清稀釋度均在1∶20～1∶40之間，對(duì)分離病毒HeN1的中和能力更低，50%中和病毒的血清稀釋度在1∶10左右(圖5A)。HeN1接種豬在感染后2周即能夠產(chǎn)生高水平的中和抗體，50%中和病毒的血清稀釋度均在1∶80以上，而且對(duì)兩種病毒的中和能力均較高(圖5B)。

3 討 論

PR是危害養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病，目前PR防制主要依靠接種基因缺失疫苗。歐盟許多國(guó)家通過(guò)使用gE-的基因缺失疫苗和與之相配套的鑒別診斷方法控制和根除了PR。我國(guó)于上世紀(jì)70年代從匈牙利引進(jìn)了PRV Bartha k61株[7-8]，該病毒株是公認(rèn)的優(yōu)良疫苗株，上世紀(jì)90年代以來(lái)國(guó)內(nèi)規(guī)?；i場(chǎng)普遍使用該疫苗，使PR得到了很好的控制[9-10]。但近一年多來(lái)不斷有豬場(chǎng)發(fā)生PR流行，并且呈逐漸嚴(yán)重的趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)室從黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、河南等省的豬場(chǎng)送檢發(fā)病豬組織中通過(guò)PCR和細(xì)胞接種證明為PRV野毒感染。這些豬場(chǎng)均按照正常程序接種PRV Bartha k61疫苗，因此新分離的病毒是否發(fā)生了變異有待深入研究。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)檢測(cè)和分離的野毒株gE基因進(jìn)行了測(cè)序并與GenBank中登錄的相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)，其同源性均在97%以上，但本實(shí)驗(yàn)分離的PRV均在一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的分支中，是否這些病毒株形成一個(gè)新的流行毒株群還有待更多的分子流行病學(xué)數(shù)據(jù)來(lái)驗(yàn)證。

近期發(fā)生PR豬場(chǎng)的主要表現(xiàn)為仔豬出生后有腹瀉和神經(jīng)癥狀，死亡率較高，發(fā)生類似癥狀的豬場(chǎng)有時(shí)誤診該病為高致病性豬藍(lán)耳病、豬瘟和流行性腹瀉。另外，PRV感染豬幾乎不形成病毒血癥，因此在血液中檢出PRV的概率很低，而我們?cè)诓×系臋z測(cè)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)腦組織的病毒含量高，因此該病的診斷應(yīng)盡量以發(fā)病豬的腦組織檢測(cè)為主。PRV基因組GC含量高達(dá)70%，設(shè)計(jì)檢測(cè)病毒的PCR引物難度較大，有時(shí)造成檢測(cè)樣品不夠敏感。由于以上原因，PR目前在我國(guó)的流行現(xiàn)狀還不清楚。

利用微量中和試驗(yàn)進(jìn)行血清學(xué)分析表明，Bartha k61株接種豬血清產(chǎn)生中和抗體水平較低，對(duì)HeN1分離株的中和能力差，而HeN1分離株接種豬血清產(chǎn)生抗體水平高，而且對(duì)Bartha k61株也具有較高的交叉中和能力，表明PR現(xiàn)地流行的病毒株與疫苗株之間在抗原性存在一定的差異。但現(xiàn)有疫苗株對(duì)HeN1分離株免疫保護(hù)效果還有待動(dòng)物試驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證。

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