C5a受體拮抗劑對(duì)小鼠缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

鄭力通 馬銘澤 晏沐陽(yáng) (解放軍總醫(yī)院心血管病研究所，北京 00853)

大腦短暫缺血后，恢復(fù)血供時(shí)會(huì)發(fā)出一個(gè)強(qiáng)烈的炎癥應(yīng)答，引起腦組織繼缺血后的第2次損傷，即腦缺血/再灌注(I/R)損傷。補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)是這種炎癥事件的一個(gè)重要遞質(zhì)。在不同的器官系統(tǒng)(包括心肌、腸道、四肢)的I/R損傷都涉及補(bǔ)體激活，也被公認(rèn)作為一個(gè)可能的I/R損傷治療靶點(diǎn)〔1～4〕。有針對(duì)性的觀察補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)的各個(gè)組成部分，探究腦I/R損傷的發(fā)病機(jī)制，可確定它們各自的作用和價(jià)值〔5〕。補(bǔ)體分子C5通過經(jīng)典或替代途徑裂解成C5a和C5b，C5b同C6～C9形成膜攻擊復(fù)合物，這可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞和細(xì)菌的裂解〔6〕。C5a是一種過敏毒素，是一種強(qiáng)效的炎癥細(xì)胞聚集和激活的始作俑者，因此表現(xiàn)出調(diào)節(jié)炎癥的特點(diǎn)。本文旨在探討C5a受體拮抗劑對(duì)小鼠I/R損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用鼠 健康雄性C57Bl/6小鼠，鼠齡8～10 w、體重22～26 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為空白對(duì)照組、磷酸鹽緩沖液(PBS)組、C5a受體拮抗劑(C5aRA)組，每組8只。在缺血發(fā)作前45 min，對(duì)每個(gè)雄性C57Bl/6老鼠按照1 mg/kg的量腹腔注射C5aRA或同等體積的PBS液體。

1.2 小鼠腦I/R模型的制作〔7〕小鼠1%戊巴比妥鈉，腹腔麻醉后，仰臥位固定，頸部中線切口。分離小鼠右側(cè)頜下腺提反向外側(cè)，分離并暴露右側(cè)的頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈，并在近心端結(jié)扎頸總動(dòng)脈，在遠(yuǎn)心端結(jié)扎頸外動(dòng)脈，離斷頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)端。沿頸內(nèi)動(dòng)脈向深部繼續(xù)分離暴露翼腭動(dòng)脈后，血管夾同時(shí)夾閉翼腭動(dòng)脈。在頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端用顯微剪刀剪一小口，插入制備好的線段(8個(gè)0的單絲線，長(zhǎng)約11 mm，前段均勻包被一層硅膠使尖端圓鈍)，轉(zhuǎn)過頸總動(dòng)脈分叉，進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈。插入線段直至遇到阻力，插入長(zhǎng)度以過頸總動(dòng)脈分叉約0.8 cm為宜，即線段外露1 mm左右。插線結(jié)束后，將預(yù)先放置于頸外動(dòng)脈的結(jié)扎線縛緊，以防止線段滑出和出血。頸部傷口常規(guī)縫合。60 min后，再次麻醉小鼠，分離暴露右側(cè)頸外動(dòng)脈，松開固定線，拔除線段即可實(shí)現(xiàn)再灌注。

1.3 神經(jīng)功能缺失評(píng)分 Longa 5分法評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):0分表示無(wú)異常;1分提尾時(shí)左前肢內(nèi)收，表示輕度運(yùn)動(dòng)低下;2分為向左側(cè)傾斜;3分向左側(cè)旋轉(zhuǎn);4.0分不能自行行走或昏迷。1～4分為有效模型。

1.4 腦梗死灶大小的計(jì)算 術(shù)后24 h斷頭取腦，置于小鼠腦冠狀切片磨具中，切成2 mm厚片。將切片置于2%紅四氮唑(TTC)磷酸鹽緩沖液中，避光染色30 min后，置于10%多聚甲醛中固定。白色為梗死灶，紅色為正常腦組織。應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)測(cè)量腦梗死面積。根據(jù)公式V=t×(A1+A2+…+An)算出梗死體積。其中t為切片厚度，A為每個(gè)切片尾側(cè)梗死面積，n為單個(gè)鼠腦的切片數(shù)。t=2 mm，n=4。

1.5 組織病理學(xué)觀察 術(shù)后24 h，1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔麻醉后，開胸暴露心臟，用PBS心臟沖洗后，4%多聚甲醛(pH7.2～7.4)灌注，斷頭取腦，置于相同灌注液12 h后依次脫水、透明、浸蠟及包埋，行5 μm厚冠狀切片，進(jìn)行HE染色。

同樣，C5與其他器官系統(tǒng)的再灌注損傷也有關(guān)聯(lián)。C5aRA是一種環(huán)肽。目前研究最廣泛的是AcF〔OpdChaWR〕(PMX-53)。已被證明在不同的嚙齒動(dòng)物疾病模型中可明顯阻礙C5a的介導(dǎo)效果〔11〕。局部缺血前應(yīng)用C5aRA能充分抑制I/R誘導(dǎo)的腎損害〔12〕。此外，抗C5抗體和C5aRA都已被證明減弱局部缺血鼠小腸的再灌注損傷〔13，14〕。這些發(fā)現(xiàn)表明，與遺傳缺陷對(duì)比，在缺血前期改變C5或C5a的活性對(duì)急性炎癥更有針對(duì)性，從而限制再灌注損傷。

但C5a受體介導(dǎo)確切的調(diào)節(jié)機(jī)制仍然未知。未來的研究必須闡明作用機(jī)制，即通過上調(diào)腦中C5aR后腦I/R損傷和靶向，來調(diào)解其效能。此外，繼續(xù)努力追蹤驗(yàn)證缺血后療效。定義C5a受體抑制對(duì)I/R損傷的治療窗將至關(guān)重要，在評(píng)估其治療I/R損傷相關(guān)目標(biāo)的臨床潛能。此外，鑒于在心肌缺血患者亞組的抗C5療法最近的臨床療效和安全性特點(diǎn)〔15〕，應(yīng)觀察腦缺血中C5a的作用以及其在I/R損傷治療中的深遠(yuǎn)潛力和有利進(jìn)展。

2 結(jié)果

2.1 梗死體積 與PBS組(35.0% ±2.1%)比較，C5aRA組梗死體積(26.2% ±2.5%)顯著減少(P=0.02)。見圖 1。C5aRA組梗死體積比PBS組減少了26%。

圖1 兩組梗死體積

2.2 神經(jīng)功能缺損 C5aRA組(2.3±0.15)比PBS組(2.4±0.11)在神經(jīng)功能缺損評(píng)分上有改善的趨勢(shì)(P=0.09)。

3 討論

腦血管疾病發(fā)病機(jī)制及安全有效的治療措施目前還不清

1 Arumugam TV，Shiels IA，Woodruff TM，et al.The role of the complement system in ischemia-reperfusion injury〔J〕.Shock，2004;21:401-9.

2 Cannon RO 3rd.Mechanisms，management and future directions for reperfusion injury after acute myocardial infarction〔J〕.Nat Clin Pract Cardiovasc Med，2005;2:88-94.

3 Cerqueira NF，Hussni CA，Yoshida WB.Pathophysiology of mesenteric ischemia/reperfusion:a review〔J〕.Acta Cir Bras，2005;20:336-43.

4 D'Ambrosio AL，Pinsky DJ，Connolly ES.The role of the complement cascade in ischemia/reperfusion injury:implications for neuroprotection〔J〕.Mol Med，2001;7:367-82.

5 Mocco J，Mack WJ，Ducruet AF，et al.Complement component C3 mediates inflammatory injury following focal cerebral ischemia〔J〕.Circ Res，2006;99:209-17.

6 Arumugam TV，Magnus T，Woodruff TM，et al.Complement mediators in ischemia-reperfusion injury〔J〕.Clin Chim Acta，2006;374:33-45.

7 Koizumi J，Yoshida Y，Nakazawa T.Experimental studies of ischemic brain edema:A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be induced in the ischemic area〔J〕.Stroke，1986;17(6):1203-10.

8 Xi G，Keep RF，Younger JG，et al.Systemic complement depletion disminishes perihematomal brain edema in rats〔J〕.Stroke，2001;32(1):162-7.

9 Arumugam TV，Shiels IA，Woodruff TM，et al.The role of the complement system in ischemia-reperfusion injury〔J〕.Shock，2004;21:401-9.

10 Costa C，Zhao L，Shen Y，et al.Role of complement component C5 in cerebral ischemia/reperfusion injury〔J〕.Brain Res，2006;1100:142-51.

11 Morikis D，Roy M，Sahu A，et al.The structural basis of compstatin activity examined by structure-functionbased design of peptide analogs and NMR〔J〕.J Biol Chem，2002;277:14942-53.

12 Arumugam TV，Shiels IA，Strachan AJ，et al.A small molecule C5a receptor antagonist protects kidneys from ischemia/reperfusion injury in rats〔J〕.Kidney Int，2003;63:134-42.

13 Heller T，Hennecke M，Baumann U，et al.Selection of a C5a receptor antagonist from phage libraries attenuating the inflammatory response in immune complex disease and ischemia/reperfusion injury〔J〕.J Immunol，1999;163:985-94.

14 Wada K，Montalto MC，Stahl GL.Inhibition of complement C5 reduces local and remote organ injury after intestinal ischemia/reperfusion in the ra〔tJ〕.Gastroenterology，2001;120:126-33.

15 Mahaffey KW，Van de Werf F，Shernan SK，et al.Effect of pexelizumab on mortality in patients with acute myocardial infarction or undergoing coronary artery bypass surgery:a systematic overview〔J〕.Am Heart J，2006;152:291-6.