HPV16/18和端粒酶在宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌中的表達(dá)及臨床意義

丁聰聰 姜曉萍 (廣東醫(yī)學(xué)院中美聯(lián)合腫瘤研究所，廣東 東莞 523808)

宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)是一組與宮頸浸潤密切相關(guān)的癌前期病變，反映了宮頸癌(CC)發(fā)生中連續(xù)發(fā)展的過程，CIN的早期篩查、診斷能有效降低CC的發(fā)病率。因此，臨床上迫切需要一種可靠的指標(biāo)以早期發(fā)現(xiàn)CIN，阻止其向浸潤性癌方向發(fā)展〔1〕。本研究采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)和重復(fù)片段擴(kuò)增方法銀染定性法(TRAP-PCR)，對所有樣本宮頸組織中人端粒酶基因(hTERC)和人乳頭瘤病毒(HPV16/18)的感染和表達(dá)情況進(jìn)行檢測，以期了解HPV16/18和hTERC的表達(dá)與CIN和CC的關(guān)系，旨在為CIN和CC早期診斷提供新的指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選擇2010年1月至2012年1月我院收治的CIN和CC患者各30例。30例CIN病例年齡45～57〔平均(49.6±6.4)〕歲，其中CINⅠ10例，CINⅡ9例，CINⅢ 11例;30例CC病例均為浸潤性CC(ICC)，年齡55～65〔平均(57.8±5.8)〕歲。所有CIN和CC病例均符合國家衛(wèi)生部發(fā)布的《子宮頸癌診斷》關(guān)于CIN和ICC的診斷標(biāo)準(zhǔn)〔2〕，并經(jīng)細(xì)胞學(xué)檢查和陰道鏡檢查確診。隨機(jī)選擇同時期在本院門診就診的宮頸正常30例病理標(biāo)本作為對照，年齡55～67〔平均(60.1±5.9)〕歲。所有病例均未接受過放療或化療、宮頸和子宮切除手術(shù)和服用過激素類藥物治療。各組病例在年齡等各方面具有均衡性(P＞0.05)。同時，研究前均告知患者或其家屬，并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 組織標(biāo)本采集 用薄層液基細(xì)胞學(xué)宮頸刷插入宮頸口，取病例宮頸的新鮮組織，立即用無菌雙蒸水洗滌，將洗滌后的組織用手術(shù)刀片盡可能切碎，置入1.5 ml無菌離心管內(nèi)。

1.2.2 HPV16/18 PCR擴(kuò)增和電泳檢測 分別采用QIA Mini試劑盒(QIAGEN，美國)和病毒核酸試劑盒(Roche，德國)提取宮頸組織中HPV16/18 DNA模板。采用PCR擴(kuò)增反應(yīng)和聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳對患者血中HPV DNA進(jìn)行檢測。以HPV16/18 DNA模板，利用PCR擴(kuò)增反應(yīng)對所有90個病例的血液DNA提取物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序如下:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性40 s，60℃退火 35 s，72℃延伸 45 s，重復(fù) 30循環(huán);72℃延伸5 min 1個循環(huán);4.0℃保存。在10%非變性PAGE上電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，銀染觀察結(jié)果。擴(kuò)增的引物序列HPV16為前向:5'TTATTTTGAGCTTTGGTTCTG3';反向:5'CCCGCTTTC GTAGTTTCAT3';HPV18為前向:5'TGCAGCACGAATAAGGCACTGGCCTC3';反向:5'CACGGCGACCCTACAAGCTACGG3'，由上海生工合成。HPV 16的陽性擴(kuò)增片段大小為184 bp，而HPV 18的陽性擴(kuò)增片段為154 bp。

1.2.3 hTERC PCR擴(kuò)增和電泳檢測 hTERC擴(kuò)增模板參照虞偉等〔3〕公布的方法。采用TRAP和PAGE電泳對患者組織中hTERC DNA進(jìn)行檢測。擴(kuò)增程序同上，引物序列為TS:5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3';CX:5'-CCCTTACCCTTACCCTTAC CCTAA-3'。凡在凝膠電泳上顯示相隔6 bp的梯狀條帶，表示樣本為hTERC陽性，陰性表達(dá)者僅出現(xiàn)一條35 bp內(nèi)對照條帶，條帶的深淺表示hTERC活性的大小。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析，關(guān)聯(lián)分析采用Logistic回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 HPV16/18 PAGE電泳檢測結(jié)果 分別從ICC、CINⅠ～Ⅲ和正常宮頸病例中隨機(jī)選取4例進(jìn)行HPV16/18的PCR擴(kuò)增和電泳檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ICC、CINⅢ、CINⅡ、CINⅠ組和正常宮頸病例HPV16陽性條帶檢測數(shù)分別為4、4、3、2和0條。而ICC、CINⅢ、CINⅡ、CINⅠ和正常宮頸病例HPV18陽性條帶檢出數(shù)分別為4、3、2、2 和0 條。見圖1，圖2。

圖1 HPV 16 DNA檢測圖譜

圖2 HPV 18 DNA檢測圖譜

2.2 hTERC聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結(jié)果 從ICC、CINⅠ～Ⅲ和正常宮頸病例中隨機(jī)選取2例進(jìn)行hTERC的擴(kuò)增和電泳檢測，ICC、CINⅢ、CINⅡ、CINⅠ和正常宮頸病例出現(xiàn)相隔6 bp的梯狀條帶的例數(shù)分別為2、2、2、2和0條。同時顯示hTERC擴(kuò)增條帶亮度從ICC、CINⅢ、CINⅡ、CINⅠ依次減弱。見圖3。

圖3 hTERC聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測TRAP銀染結(jié)果

2.3 各組患者 HPV16/18陽性率比較 ICC HPV16/18陽性感染率極顯著高于CIN組和正常宮頸組(P＜0.01)，而CIN組HPV16/18陽性感染率顯著高于正常宮頸組(P＜0.05)。CINⅢ、CINⅡ和CINⅠ組間比較，CINⅢ HPV16/18陽性感染率極顯著高于CINⅡ和CINⅠ組(P＜0.05)，CINⅡ HPV16/18陽性感染率極顯著高于CINⅠ組(P＜0.05)。見表1。

表1 各組患者HPV16/18陽性率統(tǒng)計(jì)結(jié)果〔n(%)〕

2.4 各組患者h(yuǎn)TERC陽性率比較 ICC、CIN以及正常宮頸癌組hTERC陽性率分別為93.33%28例、53.33%(16例)和3.33%(1例)。ICC hTERC陽性感染率〔8例(72.72%)〕極顯著高于CIN組和正常宮頸組(P＜0.01)，而CIN組hTERC陽性感染率顯著高于正常宮頸組(P＜0.05)〔8例(72.72%)〕。CINⅢ、CINⅡ和CINⅠ組間比較，CINⅢ 組hTERC陽性感染率極顯著高于 CINⅡ〔5例(55.56%)〕和 CINⅠ組〔3例(30.0%)〕(P＜0.05)，CINⅡ組hTERC陽性感染率極顯著高于CINⅠ組(P＜0.05)。

2.5 HPV16/18和hTERC陽性率與CIN和ICC易感性關(guān)聯(lián)分析 CIN和ICC易感性與HPV16/18和hTERC陽性率存在顯著關(guān)聯(lián)性，其中ICC和CINⅢ與HPV16/18和hTERC陽性存在顯著正相關(guān)(P＜0.05)。而正常宮頸組織與 HPV16/18和hTERC陽性率不存在關(guān)聯(lián)性(P＞0.05)。見表2。

表2 HPV16/18和hTERC陽性與CIN和ICC易感性

3 討論

20世紀(jì)70年代末，Hausen首次提出CC的HPV病因假說，認(rèn)為CC與HPV16和18等高危型HPV的持續(xù)感染相關(guān)。HPV是一種雙鏈DNA病毒，具有球形外殼，可以寄生于受損的宮頸上皮，使宮頸處于持續(xù)感染狀態(tài)，導(dǎo)致宮頸上皮發(fā)生不典型增生，引起不同程度上皮瘤變，繼而發(fā)生CC〔4〕。近年來，國內(nèi)外眾多研究證實(shí)高危型HPV 16、18等亞型與CC發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。梅佳等〔5〕研究認(rèn)為HPV感染與CIN變呈正相關(guān)，是CIN早期篩查的理想手段。周斌等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)高危型 HPV 16/18感染與CC及CC癌前病變的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，HPV 16/1 8 DNA檢測敏感性高于液基細(xì)胞學(xué)，對宮頸炎等良性病變的陰性預(yù)測值高于液基細(xì)胞學(xué)。Cogliano等〔7〕研究認(rèn)為宮頸HPV感染的檢測結(jié)合其他輔助檢查，對預(yù)防CC的發(fā)生有一定的意義，并具有進(jìn)一步的推廣和應(yīng)用價值。Carozzi等〔8〕發(fā)現(xiàn)HPV16/18可更早發(fā)現(xiàn)CC和癌前病變，并對宮頸病變干預(yù)和治療具有重要的指導(dǎo)意義。

本研究數(shù)據(jù)表明高危型HPV16/18與CIN和ICC的發(fā)病率存在密切關(guān)聯(lián)性，可以通過檢測患者宮頸組織中HPV16/18來早期診斷患 CC，這與梅佳等〔5〕和 Carozzi等〔8〕的研究結(jié)果一致。雖然高危型HPV16/18檢測敏感性高，但特異性一般只有64% ～95%，尤其是年輕性生活活躍的婦女，許多HPV感染是暫時的，并不會導(dǎo)致CC的發(fā)生。細(xì)胞學(xué)篩查也僅是通過細(xì)胞學(xué)特征進(jìn)行診斷，缺少組織結(jié)構(gòu)特征，敏感性低，因而在診斷中也不可避免地出現(xiàn)一定的漏診或誤診。高危型HPV16/18檢測均不能同時達(dá)到較高的敏感性和特異性。因此，需要尋找其他更準(zhǔn)確、更可靠、更有預(yù)見性的方法，以彌補(bǔ)上述監(jiān)測指標(biāo)的不足〔9〕。

現(xiàn)代細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究表明，CC的發(fā)生與人類3號染色體長臂的增加密切相關(guān)，其中涉及的最重要基因是人染色體hTERC，它可以阻止細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致腫瘤的產(chǎn)生。因此，hTERC基因的異常擴(kuò)增是 CC發(fā)生的早期事件，檢測hTERC的擴(kuò)增有助于 CC的篩查及早期診斷〔10〕。近年來，hTERC與CC關(guān)系的研究也成為熱點(diǎn)，它已成為目前已知最為廣譜的惡性腫瘤的分子標(biāo)志物。趙繼紅等〔11〕采用TRAP-PCR，發(fā)現(xiàn)正常宮頸組織與CC癌變組織hTERC活性存在顯著差異，認(rèn)為hTERC在CC發(fā)生中可能起到重要作用，檢測子宮頸病變中hTERC，對探討宮頸病變的進(jìn)展和CC的發(fā)生具有重要意義。賀昕紅〔12〕采用熒光原位雜交方法，檢測60例子宮頸脫落細(xì)胞hTERC的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)hTERC基因的陽性表達(dá)與CC病變程度密切相關(guān)，提示在其發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用，hTERC基因檢測有望成為CC早期篩查方法之一。Alamed等〔13〕研究認(rèn)為檢測hTERC基因擴(kuò)增有望成為協(xié)助預(yù)測宮頸病變進(jìn)展的重要標(biāo)記物，并可能減少病理組織形態(tài)學(xué)篩查的假陰性或漏診情況。Heselmeyer等〔14〕采用TRAP檢測CC患者，發(fā)現(xiàn)hTERC在CC組織中高度表達(dá)。以上大量研究結(jié)果均顯示，活化與CC的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。本研究也表明CC和hTERC活性存在極其顯著的相關(guān)關(guān)系，可以通過檢測患者宮頸組織中hTERC活性來判定是否患CC。

1 Gastellsague X.Natural history and epidemiology of HPV infection and cervical cance〔J〕.Gynecol Oncol，2012;110(3):4-7.

2 周 莉，陳 姍，張帝開.持續(xù)性人乳頭瘤病毒感染與宮頸癌的研究進(jìn)展〔J〕.中國病理生理雜志，2010;26(12):2482-6.

3 虞 偉，談 華，武建國，等.端粒重復(fù)序列擴(kuò)增銀染色法用于端粒酶活性測定的研究〔J〕.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2000;13(2):96-7.

4 許曉紅，解正新，馬 嶸，等.HPV高危型別檢測聯(lián)合細(xì)胞學(xué)檢查對宮頸病變篩查的研究〔J〕.中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，2011;25(4):298-300.

5 梅 佳，李桂梅，楊志慧.hTERC和HPV聯(lián)合檢測在宮頸上皮內(nèi)瘤變篩查中應(yīng)用〔J〕.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2011;27(9):947-50.

6 周 斌，左新華，傅新文.高危型人乳頭狀瘤病毒16/18型DNA檢測在宮頸病變篩查中的應(yīng)用價值〔J〕.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2012;27(5):393-5.

7 Cogliano V，Bane R，Straif K，et al.Carcinogenicity of human papillomavius〔J〕.Lancet Oncol，2005;6(4):204-7.

8 Carozzi FM，Burroni E，Bisanzi S，et al.Comparison of clinical performance of Abbott real time high risk HPV test with that of hybrid capture 2 assay in a screening setting〔J〕.J Clin Microbiol，2011;49(4):1446-51.

9 Hopman AH，Theelen W，Hommelberg PP，et al.Genomic integration of oncogenic HPV and gain of the human telomerase gene TERC at 3q26 are strongly associated events in the progression of uterine cervical dysplasia to invasive cancer〔J〕.J Pathol，2011;210(4):412-9.

10 Cox JT.History of the use of HPV testing in cervical screening and in the management of abnormal cervical screening results〔J〕.J Clin Virol，2009;45(1):3-12.

11 趙繼紅，何建芳，溫永琴，等.hTERC基因在不同級別宮頸病變中的表達(dá)與意義〔J〕.海南醫(yī)學(xué)，2011;22(6):133-5.

12 賀昕紅.宮頸病變中人類染色體端粒酶基因與高危型人乳頭瘤病毒感染相關(guān)性研究〔J〕.中國全科醫(yī)學(xué)，2011;14(29):3347-9.

13 Alamed F，Espinet B，Corzo C，et al.3q26(hTERC)gain studied by fluorescence in situ hybridization as a persistence-progression indicator in low-grade squamous intraepithelial lesion cases〔J〕.Human Pathology，2009;40(10):1474-8.

14 Heselmeyer HK，Janz V，Castle PE，et al.Detection of genomic amplification of the human telomerase gene(TERC)in cytologic speciements as a genetic test for the diagnosis of cervical dysplasia〔J〕.Am J Pathol，2010;163(4):1405-16.