• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    一株柑橘木虱蟲生真菌的分離與鑒定

    2013-09-11 12:43:20鹿連明杜丹超胡秀榮蒲占湑張小亞陳國慶
    浙江農(nóng)業(yè)科學 2013年10期
    關鍵詞:木虱分生孢子蟲體

    鹿連明,杜丹超,胡秀榮,蒲占湑,張小亞,陳國慶

    (浙江省柑桔研究所,浙江臺州 318026)

    柑橘木虱 (Diaphorina citri)屬同翅目木虱科,是柑橘、檸檬、黃皮、九里香、枸杞等蕓香科植物新梢期的主要害蟲,也是傳播柑橘黃龍病的唯一自然蟲媒。柑橘黃龍病作為當前柑橘生產(chǎn)上防治最難、威脅最大的一種毀滅性病害,對柑橘產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定和發(fā)展帶來了嚴重威脅。但目前對該病害尚未獲得有效的防治藥劑,以防治柑橘木虱為主的綜合防治是當前該病害防控的主要辦法。因此,加強對柑橘木虱的防治,無論對于控制柑橘黃龍病的流行還是降低蟲體本身對柑橘的危害都具有重要意義。

    目前對柑橘木虱的防治多采用化學防治措施,由此造成了農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染、生物多樣性破壞和柑橘木虱抗藥性等諸多問題,而生物農(nóng)藥以其高效、低毒、低殘留、無污染、不易產(chǎn)生抗藥性和原料易得等特性被認為是未來化學農(nóng)藥的理想替代藥劑。國內外研究者在利用植物提取物、昆蟲天敵和生防菌等防治柑橘木虱方面進行了諸多有益的嘗試[1],但研究多處于實驗室階段,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中利用生防菌制劑成功防治的實例尚未見報道。因此,柑橘木虱蟲生真菌的進一步分離篩選和生物潛能的研究,對于促進將來柑橘木虱生物防治的順利開展具有重要的意義。本研究通過采集柑橘木虱蟲體,并從中分離出病原菌,以期篩選出對柑橘木虱具有較強致病力的菌株,以豐富現(xiàn)有的柑橘木虱蟲生真菌資源,為將來柑橘木虱生防菌的開發(fā)利用提供材料。

    1 材料與方法

    1.1 供試蟲源

    分離病原菌所用的柑橘木虱蟲體采集于浙江省臺州市黃巖區(qū)不同柑橘園內;測定病原菌的致病性所用的健康柑橘木虱成蟲為浙江省柑橘研究所溫室中九里香植株上常年繼代飼養(yǎng)的種群。

    1.2 試劑和培養(yǎng)基

    dNTP、r-Taq酶等 PCR相關試劑,TaKaRa公司;CTAB、巰基乙醇、異丙醇,Amersco公司;核酸染料GelRed,Biotium公司;凝膠回收試劑盒,Axygen公司。其余試劑為國產(chǎn)分析純。

    用于病原真菌分離培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂 (PDA)培養(yǎng)基。稱取200 g馬鈴薯,洗凈去皮切碎,加水1 000 mL煮沸0.5 h,紗布過濾,再加20 g葡萄糖和20 g瓊脂,充分溶解后用熱紗布過濾,分裝至錐形瓶或玻璃試管中,121℃,高壓滅菌20 min。

    1.3 引物

    所用引物為擴增真菌ITS區(qū)域的通用引物ITS5(5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3') 和 ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'),由上海 Invitrogen公司合成。

    1.4 病菌的分離純化

    將田間采集的柑橘木虱置于無菌離心管中帶回實驗室,對蟲體表面已有肉眼可見菌絲體的柑橘木虱蟲尸,直接放于PDA培養(yǎng)基中;對柑橘木虱活蟲或表面無菌絲的蟲尸,先置于70%乙醇中浸泡30 s,再經(jīng)0.1%升汞浸泡3 min后,用無菌水沖洗3次,用無菌濾紙吸干蟲體上的水分,再置于PDA培養(yǎng)基中。隨后將各載有蟲體的培養(yǎng)基置于28℃微生物培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng),至蟲體周圍長出菌絲后,挑取菌絲轉至新的PDA平板上培養(yǎng) (重復此操作2~3次),待菌落上產(chǎn)生分生孢子,用無菌水洗脫分生孢子制備成分生孢子懸浮液,然后用稀釋純化法對病菌進行單孢分離。最后將分離純化獲得的菌株保存于PDA斜面培養(yǎng)基中,培養(yǎng)3~4 d后,置于4℃冰箱保存。

    1.5 致病菌的篩選

    將上述分離純化保存的菌株接種到PDA平板上,于28℃恒溫培養(yǎng)10 d后,以無菌水洗脫菌落上產(chǎn)生的分生孢子,制備分生孢子懸浮液。以血球計數(shù)板確定孢子懸浮液的濃度,并向其中加入適量的吐溫80至終濃度為0.1%。取溫室飼養(yǎng)的健康柑橘木虱成蟲浸沒于含0.1%吐溫80的分生孢子懸浮液中10~15 s,挑取處理后仍能自由活動的柑橘木虱置于培養(yǎng)皿中的九里香葉片上 (培養(yǎng)皿底部鋪有2層用無菌水濕潤過的濾紙,其上放置一個帶有10個左右葉片的九里香嫩枝,枝條底端以無菌水濕潤的脫脂棉包裹),然后放于28℃光照培養(yǎng)箱中 (每天14 h光照/10 h黑暗,濕度95%以上)培養(yǎng)。上述每處理重復3次,每個重復為30頭柑橘木虱;同時設含0.1%吐溫80的無菌水處理柑橘木虱為對照。于體視顯微鏡下觀察病菌對柑橘木虱的侵染和致死情況,記錄上述各處理的柑橘木虱的總蟲數(shù)和死亡蟲數(shù),計算死亡率和校正死亡率。

    通過上述方法,從處理后的柑橘木虱蟲體中分離病菌,比較再分離的病菌與初始接種病菌的形態(tài)特征和培養(yǎng)特征,篩選出符合科赫氏法則的對柑橘木虱具致病性的菌株,排除從柑橘木虱蟲體上分離到的腐生菌等非致病菌。

    1.6 菌株GJMS032培養(yǎng)特征和形態(tài)特征

    將上述分離純化的菌株GJMS032接種到PDA培養(yǎng)基平板中央,置于28℃恒溫培養(yǎng),每日觀察菌落生長情況,并記錄菌落顏色和形態(tài)。將菌株GJMS032接種到另一PDA培養(yǎng)基平板中央,同時將滅菌后的蓋玻片 (1 cm×1 cm)斜插入距接種點約1 cm處的培養(yǎng)基內,置于28℃恒溫培養(yǎng)約5 d,待菌絲爬到蓋玻片上后,取出蓋玻片置于光學顯微鏡下觀察菌株GJMS032的菌絲和孢子形態(tài)。

    1.7 菌株GJMS032的序列分析

    1.7.1 總DNA的提取

    將菌株GJMS032接種至PDA培養(yǎng)基平板,置于28℃恒溫培養(yǎng)至菌落長滿整個培養(yǎng)皿,以無菌藥匙刮取平板上生長的真菌菌絲于無菌研缽中,加入液氮研磨至粉末狀,采用改良的CTAB法提取菌株GJMS032的總DNA。具體方法為:加入1 mL預熱的2%的CTAB緩沖液及10~20 μL β-巰基乙醇,轉移到1.5 mL離心管中,于65℃水浴30~60 min;加入酚/氯仿/異戊醇 (25∶24∶1)抽提1~2次;再用氯仿/異戊醇 (24∶1)抽提1次;取上清,加入預冷的異丙醇,-20℃放置30~60 min以沉淀DNA;適量75%乙醇洗滌沉淀2次;沉淀于室溫下自然晾干,然后于10~20 μL TE(含RNase 50 mg·L-1)中溶解,所得溶液即為樣品DNA溶液。取1 μL溶液上樣于0.8%的瓊脂糖凝膠上進行電泳,檢測所提取的DNA質量。

    1.7.2 PCR擴增

    以提取純化的DNA為模板,以通用引物ITS5和ITS4 擴增菌株 GJMS032 的 ITS1-5.8S rDNA-ITS2基因。PCR反應體系為:10×Buffer 2.5 μL,dNTPs 2 μL,上下游引物 (10 μmol·L-1)各 1.5 μL,r-TaqDNA聚合酶0.2 μL,DNA模板1 μL,無菌水補足至總體積25 μL。反應條件為94℃ 5 min,94℃1 min,55℃ 1 min,72℃ 1 min,35個循環(huán),72℃10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳觀察拍照。

    1.7.3 測序及序列分析

    于瓊脂糖凝膠上割取PCR產(chǎn)物的目的條帶,利用Axygen膠回收試劑盒回收純化,然后送交至Invitrogen公司利用引物ITS5/ITS4進行兩端測序。利用NCBI Blast對所測序列進行比對分析,查看其與GenBank中已知物種對應序列的相似性。選取GenBank中與之同源性較高的一些菌種的序列,利用Clustal X進行多重比對后,使用MEGA 5.05軟件,通過Neighbor joining方法構建系統(tǒng)發(fā)育樹,在構建系統(tǒng)發(fā)育樹時進行自舉檢驗,重復抽樣1 000次。

    2 結果與分析

    2.1 菌株GJMS032的致病性

    通過篩選獲得1株對柑橘木虱具有致病力的菌株,命名為 GJMS032。以1.0×109spores·mL-1菌株分生孢子懸浮液處理柑橘木虱后3 d,校正死亡率為38.5%;處理后7 d,校正死亡率達98%。處理后第2天,通過體視顯微鏡,即可在一些蟲體表面觀察到菌絲長出,至7 d后,肉眼可見菌株GJMS032的產(chǎn)孢結構 (圖1)。

    圖1 菌株GJMS032對柑橘木虱的侵染

    2.2 菌株GJMS032的培養(yǎng)特征和形態(tài)特征

    菌株GJMS032在PDA培養(yǎng)基上于25℃恒溫培養(yǎng)7 d,其菌落直徑可達5 cm,具同心環(huán)紋。菌絲體為白色,分生孢子呈赭黃色,質地絲絨狀,具少量無色滲出液,菌落反面為黃褐色。

    光學顯微鏡下觀察菌株的分生孢子頭呈球形,分生孢子梗直立,孢梗莖長650~1 600 μm,寬10~15 μm,莖壁粗糙,頂囊球形或近球形,直徑25~45 μm,產(chǎn)孢結構雙層,?;笮?~7 μm×2.5~4 μm,瓶梗大小為8 ~12 μm ×3 ~4 μm;分生孢子為球形或近球形,直徑2.5~3.5 μm(圖2)。

    圖2 菌株GJMS032在光學顯微鏡下的形態(tài)特征

    2.3 菌株GJMS032的序列分析

    經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測,通用引物ITS5/ITS4擴增菌株GJMS032的PCR產(chǎn)物大小為610 bp左右。測序后選取其中的ITS1-5.8S rDNA-ITS2基因區(qū)域,利用NCBI Blast進行在線比對。分析發(fā)現(xiàn),所測序列與GenBank中Aspergillus westerdijkiae和A.ochraceus多個分離物的序列相似性達98% ~100%。

    在系統(tǒng)發(fā)育樹中 (圖3),菌株GJMS032與A.westerdijkiae,包括模式菌株 NRRL3174(GenBank NO.EF661427)在內的多個分離物及A.ochraceus的幾個分離物聚為1個分支,而A.ochraceus的模式菌株 (GenBank No.AY373856)及其他幾個分離物和曲霉屬其他幾個種的菌株聚為另外1個分支。基于上述關于形態(tài)特征和培養(yǎng)特征的描述及對ITS1-5.8S rDNA-ITS2 序列的 分析,可 將 菌 株GJMS032初步鑒定為A.westerdijkiae。

    圖3 基于ITS1-5.8S rDNA-ITS2基因構建的菌株GJMS032系統(tǒng)發(fā)育樹

    3 小結與討論

    目前已報道的對柑橘木虱具有致病作用的真菌有擬青霉屬的宛氏擬青霉 (Paecilomyces varioti)和玫煙色擬青霉 (P.fumosoroseus)、白僵菌屬的球孢白僵菌 (Beauveria bassiana)、綠僵菌屬的金龜子綠僵菌 (Metarhizium anisopliae)、被毛孢屬的檬形被毛孢 (Hirsutella citriformis)、筍頂孢屬的蚜筍頂孢霉 (Acrostalagmus aphidium)、鐮孢屬的黃色鐮刀菌 (Fusarium culmorum)、輪枝孢屬的蠟蚧輪枝菌 (Lecanicillium lecanii)、枝孢屬的尖孢枝孢菌(Cladosporiumoxysporum)及柑橘煤炱菌(Capnodium citri)、匍柄霉 (Stemphyliumsp.)等[2-3]。對于曲霉屬真菌侵染柑橘木虱的研究報道較少。上世紀80年代,陳祝安等[2]從田間發(fā)病的柑橘木虱蟲體上分離到了日本曲霉 (A.japonica),但未對其致病性進行驗證。

    根據(jù)培養(yǎng)特征、形態(tài)特征及ITS1-5.8S rDNAITS2序列,可將所分離的菌株GJMS032鑒定為曲霉屬的一種真菌。但其ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列與 GenBank中曲霉屬的A.westerdijkiae和A.ochraceus的多個分離物均具有較高的同源性,難以鑒定其具體為哪一個種。通過查閱文獻發(fā)現(xiàn),A.westerdijkiae是近年來從A.ochraceus新分離出來的一個種,原來A.ochraceus的一些分離物現(xiàn)已被重新鑒定為A.westerdijkiae。2個菌種的形態(tài)特征具有高度的相似性,但可通過 ITS1-5.8S rDNA-ITS2和 β-tubulin 基因序列區(qū)分開來[4-8]。在系統(tǒng)發(fā)育樹上,菌株GJMS032與A.westerdijkiae的模式種聚為一個分支,其中也含有多個A.ochraceus的分離物,推測認為這些A.ochraceus分離物可能未得到重新鑒定更新而沿用了以前的名稱,實際可能是A.westerdijkiae。而A.ochraceus的模式種和其他多個分離物處于另外一個分支中?;谝陨戏治?,將菌株初步鑒定為A.westerdijkiae。

    曲霉屬真菌種類繁多,在世界范圍內廣泛分布。其中作為蟲生真菌報道過的種類有A.flavus、A.parasiticus、A.oryzae、A.tamarii、A.ochraceus、A.niger和A.candidus等[9]。如 Kodaira 等[10]從A.ochraceus侵染的家蠶幼蟲的血液中提取的物質注入健康家蠶的體腔中能致死家蠶,從而表明毒素的存在;Robert等[11]研究發(fā)現(xiàn),A.ochraceus在昆蟲體內可產(chǎn)生赭曲霉素,通過體腔注射美國白蛾可使其麻痹死亡。Vega等[12]發(fā)現(xiàn),A.westerdijkiae可侵染咖啡果小蠹的寄生蜂Prorops nasuta,并可產(chǎn)生赭曲霉素A。本研究所分離的菌株GJMS032,初步鑒定為A.westerdijkiae,對柑橘木虱具有較強的致病作用。遺憾的是,曲霉屬真菌通常會產(chǎn)生多種對人和動物有害的毒素,如赭曲霉毒素通常對腎有危害及對免疫系統(tǒng)有毒性[13],因此難以在植物病蟲害的生物防治中推廣應用。

    [1]杜丹超,鹿連明,張利平,等.柑橘木虱的防治技術研究進展 [J].中國農(nóng)學通報,2011,27(25):178-181.

    [2]陳祝安,曹光照,許益?zhèn)ィ?柑桔害蟲病原真菌資源的考察和生測[J].微生物學通報,1985,12(5):194-198.

    [3]Meyer JM,HoyM A,BouciasD G. Isolation and characterization of anIsaria fumosoroseaisolate infecting the Asian citrus psyllid in Florida [J].Journal of Invertebrate Pathology,2008,99(1):96-102.

    [4]Frisvad J C,F(xiàn)rank J M,Houbraken J A M P,et al.New ochratoxin A producing species ofAspergillussectionCircumdati[J].Studies in Mycology,2004,50(1):23-43.

    [5]Gil-Serna J,Vázquez C,Sardi?as N,et al.Discrimination of the main Ochratoxin A-producing species inAspergillussectionCircumdatiby specific PCR assays [J].International Journal of Food Microbiology,2009,136(1):83-87.

    [6]Noonim P,MahakarnchanakulW,NielsenK F,etal.Isolation,identification and toxigenic potential of ochratoxin A-producingAspergillusspecies from coffee beans grown in two regions ofThailand [J]. InternationalJournalofFood Microbiology,2008,128(2):197 -202.

    [7]Gil-Serna J,González-Salgado A,González-Jaén M T,et al.ITS-based detection and quantification ofAspergillus ochraceusandAspergillus westerdijkiaein grapes and green coffee beans by real-time quantitative PCR [J].International Journal of Food Microbiology,2009,131(2/3):162-167.

    [8]Morello L G,Sartori D,de Oliveira Martinez A L,et al.Detection and quantification ofAspergillus westerdijkiaein coffee beans based on selective amplification of β-tubulin gene by using real-time PCR [J]. International Journal of Food Microbiology,2007,119(3):270 -276.

    [9]蒲蟄龍,李增智.昆蟲真菌學[M].合肥:安徽科學技術出版社,1997.

    [10]Kodaira Y.Toxic substances to insects produced byAspergillus ochraceusandOospora destructor.Agricultural and Biological Chemistry,1961,25:261-266.

    [11]Roberts D W.Toxins of entomopathogenic fungi.In:microbial control of pests and plant diseases[M].New York:Academic Press,1981.

    [12]Vega F E, Posada F, Gianfagna T J, et al.An insect parasitoid carryingan ochratoxin producingfungus[J].Naturwissenschaften,2006,93(6):297-299.

    [13]黃天培,何佩茹,潘潔茹,等.食品常見真菌毒素的危害及其防止措施[J].生物安全學報,2011,20(2):108-112.

    猜你喜歡
    木虱分生孢子蟲體
    重組pET30a-EgM9蛋白高免兔血清對體外培養(yǎng)細粒棘球絳蟲發(fā)育的影響
    羊捻轉血矛線蟲病的診斷及危重病例治療
    油松枯梢病菌孢子萌發(fā)率測定方法探索
    犬絲蟲性眼炎的防治
    氣候變化對柑橘木虱潛在地理分布的影響
    油松枯梢病菌分生孢子器誘導方法探索
    亞洲柑橘木虱帶菌率的周年變化動態(tài)
    冬末春初是防治柑橘木虱好時期
    吡喹酮衍生物DW-3-15對日本血吸蟲PZQ抗性蟲體的生物學效應觀察
    香梨樹腐爛病菌分生孢子獲取方法及萌發(fā)條件的研究
    国产亚洲欧美98| 亚洲无线观看免费| 亚洲av二区三区四区| 国产野战对白在线观看| 深爱激情五月婷婷| xxxwww97欧美| 99久久99久久久精品蜜桃| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 天堂√8在线中文| 日韩欧美精品免费久久 | 男人舔奶头视频| 亚洲av免费在线观看| 丝袜美腿在线中文| 亚洲不卡免费看| 天天一区二区日本电影三级| 男女下面进入的视频免费午夜| 免费大片18禁| 欧美丝袜亚洲另类 | 日韩欧美国产一区二区入口| 国产精品精品国产色婷婷| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 久久久久久大精品| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 18+在线观看网站| 成人毛片a级毛片在线播放| 久久99热这里只有精品18| 日韩av在线大香蕉| 久久久久精品国产欧美久久久| 伦理电影大哥的女人| 亚洲欧美日韩无卡精品| 搡老妇女老女人老熟妇| 首页视频小说图片口味搜索| 成人国产综合亚洲| 免费av毛片视频| 99久久无色码亚洲精品果冻| 又爽又黄a免费视频| 亚洲色图av天堂| 精品久久久久久久久亚洲 | 亚洲欧美精品综合久久99| 久久久久久久久久成人| 亚洲精品成人久久久久久| 我要搜黄色片| 国产精品久久电影中文字幕| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 一a级毛片在线观看| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 精品久久久久久成人av| 九九在线视频观看精品| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 久久久色成人| 午夜精品一区二区三区免费看| 亚洲,欧美,日韩| 国产精品综合久久久久久久免费| 欧美午夜高清在线| 99国产精品一区二区蜜桃av| 美女cb高潮喷水在线观看| 欧美丝袜亚洲另类 | 午夜影院日韩av| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| aaaaa片日本免费| 国产精品人妻久久久久久| 久久欧美精品欧美久久欧美| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 成年免费大片在线观看| 国产乱人伦免费视频| av欧美777| 毛片一级片免费看久久久久 | 国产av麻豆久久久久久久| 成人毛片a级毛片在线播放| 久久久久久国产a免费观看| 观看美女的网站| 久99久视频精品免费| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 韩国av一区二区三区四区| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 18禁在线播放成人免费| 日韩欧美在线二视频| 国产精品98久久久久久宅男小说| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 亚洲人与动物交配视频| 日本熟妇午夜| 美女黄网站色视频| 99精品久久久久人妻精品| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 成人国产一区最新在线观看| 一区二区三区四区激情视频 | 国产一区二区在线av高清观看| 熟女人妻精品中文字幕| 97碰自拍视频| 国产亚洲欧美在线一区二区| 99热这里只有是精品在线观看 | 国产精品久久视频播放| 国产精品电影一区二区三区| 91字幕亚洲| 乱人视频在线观看| 欧美高清性xxxxhd video| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 亚洲精品日韩av片在线观看| www日本黄色视频网| 97超视频在线观看视频| 午夜激情欧美在线| 国产精品亚洲美女久久久| 精品久久久久久久久亚洲 | 精品人妻一区二区三区麻豆 | 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产乱人视频| 国产高清有码在线观看视频| 亚洲天堂国产精品一区在线| 精品人妻偷拍中文字幕| 国产三级黄色录像| 如何舔出高潮| 身体一侧抽搐| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 91麻豆av在线| 国产一级毛片七仙女欲春2| АⅤ资源中文在线天堂| aaaaa片日本免费| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 草草在线视频免费看| 性色avwww在线观看| 免费在线观看日本一区| 亚洲国产精品sss在线观看| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 精品久久久久久久久久久久久| 亚洲电影在线观看av| 欧美一区二区国产精品久久精品| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 国产精品1区2区在线观看.| 99热只有精品国产| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 一个人看视频在线观看www免费| 一a级毛片在线观看| 99riav亚洲国产免费| 日日夜夜操网爽| 亚洲精品一区av在线观看| 欧美成人性av电影在线观看| 亚洲人成网站高清观看| 午夜影院日韩av| 男女视频在线观看网站免费| 99久久精品一区二区三区| 2021天堂中文幕一二区在线观| 岛国在线免费视频观看| 国产色爽女视频免费观看| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲精品影视一区二区三区av| 国产成人a区在线观看| 中文字幕av成人在线电影| 免费大片18禁| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 午夜福利在线在线| 中国美女看黄片| 中文字幕久久专区| 男女下面进入的视频免费午夜| 日韩高清综合在线| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 久久久久久久精品吃奶| 美女被艹到高潮喷水动态| 村上凉子中文字幕在线| 久久亚洲真实| 午夜日韩欧美国产| 一进一出好大好爽视频| 又爽又黄无遮挡网站| 国产视频一区二区在线看| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 女人被狂操c到高潮| 女同久久另类99精品国产91| 国产精品女同一区二区软件 | 麻豆成人av在线观看| 欧美精品国产亚洲| 精品午夜福利视频在线观看一区| 我的老师免费观看完整版| 午夜福利免费观看在线| 九色国产91popny在线| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲性夜色夜夜综合| 免费黄网站久久成人精品 | 日本黄色片子视频| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 日本a在线网址| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 精品久久久久久久久亚洲 | 丁香六月欧美| 国产精品av视频在线免费观看| 久久久色成人| 国产精品1区2区在线观看.| 国产一区二区激情短视频| 亚洲欧美精品综合久久99| 欧美日韩黄片免| 美女xxoo啪啪120秒动态图 | 国产精品精品国产色婷婷| 高清在线国产一区| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 精品福利观看| 舔av片在线| 亚洲国产精品久久男人天堂| 日本五十路高清| 97热精品久久久久久| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 99在线视频只有这里精品首页| 欧美乱色亚洲激情| 国产一区二区在线av高清观看| 亚洲av电影不卡..在线观看| 一区二区三区高清视频在线| 俺也久久电影网| 国产午夜精品论理片| 美女黄网站色视频| 精品日产1卡2卡| 色哟哟哟哟哟哟| 亚洲七黄色美女视频| 天堂网av新在线| 搡老岳熟女国产| 亚洲欧美日韩高清专用| 国语自产精品视频在线第100页| 亚洲国产欧美人成| 乱码一卡2卡4卡精品| 日本与韩国留学比较| 一本久久中文字幕| 激情在线观看视频在线高清| a级毛片a级免费在线| 欧美高清性xxxxhd video| 好男人电影高清在线观看| 天天躁日日操中文字幕| 日韩国内少妇激情av| 国产av不卡久久| 亚洲av电影不卡..在线观看| 久久人人精品亚洲av| 日本一二三区视频观看| 看十八女毛片水多多多| 色哟哟·www| 午夜福利成人在线免费观看| 2021天堂中文幕一二区在线观| 亚洲五月婷婷丁香| 国产精品98久久久久久宅男小说| 欧美日韩乱码在线| 人人妻人人看人人澡| 精品一区二区免费观看| 亚洲av不卡在线观看| 亚洲专区中文字幕在线| 亚洲黑人精品在线| 中文在线观看免费www的网站| 在线天堂最新版资源| 国产三级中文精品| 五月玫瑰六月丁香| 国产精品久久久久久久久免 | 国产成人aa在线观看| 免费av不卡在线播放| 乱人视频在线观看| 波多野结衣巨乳人妻| 国产私拍福利视频在线观看| 亚洲精品456在线播放app | 亚洲无线在线观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 一a级毛片在线观看| 午夜激情福利司机影院| 一区二区三区高清视频在线| 欧美乱妇无乱码| 国产毛片a区久久久久| 十八禁网站免费在线| 亚洲国产精品久久男人天堂| eeuss影院久久| 国产欧美日韩一区二区精品| 中文字幕高清在线视频| 国产熟女xx| 国产激情偷乱视频一区二区| 国产精品综合久久久久久久免费| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产精品人妻久久久久久| 男女下面进入的视频免费午夜| 真人一进一出gif抽搐免费| 午夜久久久久精精品| 亚洲av五月六月丁香网| 久久久久久久午夜电影| 亚洲三级黄色毛片| 99热只有精品国产| 观看免费一级毛片| 国产精品一及| 国产在视频线在精品| 亚洲精品日韩av片在线观看| 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产高潮美女av| 亚洲精华国产精华精| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 国产一区二区在线av高清观看| 午夜激情福利司机影院| 国产乱人伦免费视频| 色综合站精品国产| 久久伊人香网站| 亚洲专区中文字幕在线| 熟女人妻精品中文字幕| 日韩免费av在线播放| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲av五月六月丁香网| 亚洲国产精品成人综合色| 亚洲一区二区三区不卡视频| 18禁在线播放成人免费| 91狼人影院| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 欧美午夜高清在线| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产私拍福利视频在线观看| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 久久中文看片网| 国产精品久久电影中文字幕| 最新中文字幕久久久久| 国产精品伦人一区二区| 精品人妻视频免费看| 无人区码免费观看不卡| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 欧美极品一区二区三区四区| 亚洲精品成人久久久久久| 欧美色欧美亚洲另类二区| 日韩免费av在线播放| 一本一本综合久久| 三级国产精品欧美在线观看| 久久久久九九精品影院| 国语自产精品视频在线第100页| 一夜夜www| 日韩欧美在线乱码| 听说在线观看完整版免费高清| 99精品在免费线老司机午夜| 国产一区二区在线av高清观看| 精品久久久久久久久久免费视频| 欧美黄色片欧美黄色片| 最近最新中文字幕大全电影3| 在线观看一区二区三区| 亚洲不卡免费看| 色噜噜av男人的天堂激情| 欧美黄色淫秽网站| 美女免费视频网站| 午夜精品久久久久久毛片777| 国产免费男女视频| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 丰满的人妻完整版| 欧美成狂野欧美在线观看| 丁香六月欧美| 午夜福利欧美成人| 日韩欧美精品免费久久 | 亚洲欧美日韩无卡精品| 最后的刺客免费高清国语| netflix在线观看网站| 日本 av在线| 一进一出抽搐动态| 欧美不卡视频在线免费观看| 欧美精品国产亚洲| 久久草成人影院| 国产午夜福利久久久久久| 亚洲av一区综合| 午夜久久久久精精品| 国产三级在线视频| 亚洲五月婷婷丁香| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 观看免费一级毛片| 亚洲18禁久久av| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产色婷婷99| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 欧美高清成人免费视频www| 成人特级av手机在线观看| 少妇的逼水好多| 国产精品爽爽va在线观看网站| 午夜免费男女啪啪视频观看 | АⅤ资源中文在线天堂| a级一级毛片免费在线观看| 国产三级黄色录像| 韩国av一区二区三区四区| 国产精品精品国产色婷婷| 久久久久免费精品人妻一区二区| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 丰满乱子伦码专区| 亚洲无线观看免费| 成人午夜高清在线视频| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 99国产精品一区二区蜜桃av| av福利片在线观看| 午夜福利视频1000在线观看| av在线蜜桃| 麻豆国产av国片精品| 日韩欧美 国产精品| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产成人欧美在线观看| 久久精品国产自在天天线| 老司机福利观看| av欧美777| 国产av一区在线观看免费| 精品久久久久久,| 在线看三级毛片| 波多野结衣高清无吗| 国模一区二区三区四区视频| 久久久久精品国产欧美久久久| 很黄的视频免费| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 国产成人福利小说| 亚洲av成人精品一区久久| 久久久久久久久久黄片| av专区在线播放| 淫秽高清视频在线观看| 天天一区二区日本电影三级| 一区二区三区免费毛片| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 午夜精品在线福利| 此物有八面人人有两片| 久久久国产成人精品二区| 精品久久久久久久久亚洲 | 丁香六月欧美| 免费av毛片视频| 婷婷丁香在线五月| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产伦在线观看视频一区| 宅男免费午夜| x7x7x7水蜜桃| 99久久九九国产精品国产免费| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 国产色爽女视频免费观看| 日韩中字成人| 99久久精品国产亚洲精品| 亚洲一区二区三区色噜噜| 天天躁日日操中文字幕| 欧美乱色亚洲激情| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 十八禁国产超污无遮挡网站| 国内揄拍国产精品人妻在线| 最新在线观看一区二区三区| 日本黄大片高清| 久久亚洲真实| 老司机深夜福利视频在线观看| 国产一区二区在线av高清观看| 九色国产91popny在线| 他把我摸到了高潮在线观看| 我要看日韩黄色一级片| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 最近最新免费中文字幕在线| 亚洲成人久久性| 免费在线观看亚洲国产| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 99国产精品一区二区三区| 天天躁日日操中文字幕| 国产免费一级a男人的天堂| 一级黄片播放器| 成人三级黄色视频| 国产大屁股一区二区在线视频| 国产高清视频在线观看网站| 在线观看舔阴道视频| 两个人视频免费观看高清| 一级黄色大片毛片| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 亚洲国产精品sss在线观看| 日本在线视频免费播放| 精品久久久久久久久av| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 97热精品久久久久久| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 亚洲精品日韩av片在线观看| 国产综合懂色| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 99久久九九国产精品国产免费| 日本一二三区视频观看| 国产精品影院久久| 国产久久久一区二区三区| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 亚洲一区二区三区不卡视频| 国模一区二区三区四区视频| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 精品福利观看| av女优亚洲男人天堂| 亚洲精品在线观看二区| 日本三级黄在线观看| 天堂√8在线中文| 亚洲无线观看免费| 国模一区二区三区四区视频| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 高清毛片免费观看视频网站| 九色国产91popny在线| 在线观看免费视频日本深夜| 男女之事视频高清在线观看| 内射极品少妇av片p| 天美传媒精品一区二区| 伊人久久精品亚洲午夜| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产精品人妻久久久久久| 中文字幕熟女人妻在线| 波多野结衣巨乳人妻| 淫秽高清视频在线观看| 色5月婷婷丁香| 黄色视频,在线免费观看| 欧美激情国产日韩精品一区| 欧美在线一区亚洲| 亚洲专区国产一区二区| 成年人黄色毛片网站| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 亚洲人与动物交配视频| 国产三级中文精品| 男人的好看免费观看在线视频| h日本视频在线播放| 91久久精品国产一区二区成人| 欧美精品啪啪一区二区三区| 嫩草影院新地址| 日本熟妇午夜| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 日本熟妇午夜| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 成人国产综合亚洲| 色播亚洲综合网| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲国产精品成人综合色| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 性插视频无遮挡在线免费观看| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 国产伦人伦偷精品视频| 欧美日韩国产亚洲二区| 美女xxoo啪啪120秒动态图 | 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 免费人成在线观看视频色| 亚洲av第一区精品v没综合| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产视频内射| 免费av毛片视频| 久久久久久久久中文| 亚洲精华国产精华精| 欧美一区二区精品小视频在线| 色av中文字幕| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 精品福利观看| 在线免费观看不下载黄p国产 | 精品久久久久久久末码| 成人国产一区最新在线观看| 色尼玛亚洲综合影院| 午夜福利免费观看在线| 女同久久另类99精品国产91| 两人在一起打扑克的视频| 国产私拍福利视频在线观看| 91狼人影院| 日本一二三区视频观看| 亚洲国产精品999在线| 淫妇啪啪啪对白视频| 日本免费a在线| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 又爽又黄无遮挡网站| 他把我摸到了高潮在线观看| av专区在线播放| 制服丝袜大香蕉在线| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 91av网一区二区| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 两个人视频免费观看高清| 又粗又爽又猛毛片免费看| 直男gayav资源| 我要看日韩黄色一级片| 日本黄色视频三级网站网址| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 天堂动漫精品| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲成人久久爱视频| 久久久成人免费电影| 免费一级毛片在线播放高清视频| 99久久无色码亚洲精品果冻| 波多野结衣高清无吗| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 男女之事视频高清在线观看| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 好男人在线观看高清免费视频| 国产免费一级a男人的天堂| 欧美成人一区二区免费高清观看| 成人性生交大片免费视频hd| av在线蜜桃| 欧美xxxx性猛交bbbb| 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产精品伦人一区二区| 婷婷六月久久综合丁香| 精品久久久久久久久久免费视频| 欧美日韩乱码在线| 国产精品综合久久久久久久免费| www.熟女人妻精品国产| 一级毛片久久久久久久久女| 不卡一级毛片| 久久99热6这里只有精品| 色吧在线观看| 免费看光身美女| bbb黄色大片| 亚洲av.av天堂| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 可以在线观看的亚洲视频| 香蕉av资源在线| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 午夜精品久久久久久毛片777| 午夜影院日韩av| 国产久久久一区二区三区| 国产高清视频在线观看网站| 啪啪无遮挡十八禁网站| 少妇熟女aⅴ在线视频| 欧美在线一区亚洲| 久久香蕉精品热| 最近在线观看免费完整版| 国产三级中文精品| 免费看日本二区| 国产欧美日韩一区二区三| av专区在线播放| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲成人免费电影在线观看| 三级毛片av免费| av欧美777| 中文字幕久久专区| 免费看美女性在线毛片视频| 亚洲专区国产一区二区| 久99久视频精品免费|