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    NO對月季采后超氧化歧化酶的影響

    2013-09-11 12:43:18芬,趙
    浙江農(nóng)業(yè)科學 2013年10期
    關鍵詞:花萼切花蒸餾水

    邱 芬,趙 根

    (1.浙江大學農(nóng)業(yè)與生物技術學院,浙江杭州 310058;2.湖州市農(nóng)業(yè)科學研究院,浙江湖州 313000)

    月季 (Rosa hybrida)被譽為花中皇后[1-2],采后生理及貯藏保鮮技術的研究對其鮮切花生產(chǎn)和采后生理理論研究具有重要意義。薛秋華等[3]研究了薩蔓莎切花衰老過程中超氧化歧化酶 (SOD)活性的變化,為延緩月季衰老提供依據(jù)。SOD是活性氧清除反應過程中第一個發(fā)揮作用的抗氧化酶,在抗氧化酶類中處于核心地位。研究表明,噴施低濃度SNP(sodium nitroprusside,硝普鈉)可有效提高南方紅豆杉幼苗SOD活性[4]。NaCl脅迫下添加外源NO提高了燕麥幼苗的株高和SOD活性[5]。王松華等[6]研究發(fā)現(xiàn),外源 NO 對 Ni毒害有緩解作用。還有研究表明,100 μmol·L-1Ni處理能使小麥幼苗 SOD等抗氧化酶活性升高[7-8]。本試驗將以SNP為外源NO供體對月季采后SOD活性影響展開研究。SNP是目前常用的NO供體。通過試驗觀察SNP處理后鮮切花月季中的SOD活性的變化,從而分析外源NO對月季SOD活性的影響。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    供試材料為月季品種薩蔓莎。訂購60枝未經(jīng)過任何處理的切花,直接干儲運回試驗室供用。選擇含苞待放,花枝大小形態(tài)基本一致的健壯花枝39枝作為試驗材料。

    1.2 主要儀器及試劑

    主要儀器。UV-2550紫外可見分光光度計,臺式高速冷凍離心機 (杭州達科,吉西今科學儀器有限公司),F(xiàn)A1104型電子天平 (上海衡平儀器儀表廠),移液槍等。

    儲備液A。稱取15.6 g NaH2PO4·2H2O于燒杯中用蒸餾水溶解,移入500 mL容量瓶中用蒸餾水定容至刻度,充分混勻。

    儲備液B。稱取35.85 g Na2HPO4·12 H2O于燒杯中用蒸餾水溶解,移入500 mL容量瓶中用蒸餾水定容至刻度,充分混勻。

    分別取上述A液8.5 mL和B液91.5 mL,用300 mL蒸餾水充分混勻后即為0.05 mol·L-1磷酸緩沖液 (pH值7.8,含0.1 mmol·L-1EDTA)。

    NBT(氯化硝基四氮唑藍)反應液。稱取0.012 04 g核黃素溶于100 mL蒸餾水中,取4 mL,稱取0.387 g甲硫氨酸,0.010 3 g NBT,加入磷酸鹽緩沖液 (pH值7.8)196 mL溶解。

    PVP(聚乙烯吡咯烷酮)。

    1.3 試驗方法

    1.3.1 瓶插處理

    以100 μmol·L-1SNP為NO的供體。試驗在室溫下進行,保持溫度、光照等因素相同,在系統(tǒng)誤差之內(nèi)。觀察月季切花在單一因素 (SNP處理)下的SOD活性變化情況。以蒸餾水為對照組。

    1.3.2 瓶插預處理

    將運回試驗室的花材去除多余葉片,留取花梗30±2 cm,由基部45°剪后即插入蒸餾水中,使花?;拷胨? cm左右,恢復24 d(誤差0.5 h),使其充分吸水。經(jīng)過預處理,挑取健壯、開放程度基本一致的月季切花共39枝,挑出3枝作試驗樣品,待測,記為第0天,其余36支分為對照 (CK)和處理 (T)2組,重復3次。其中對照組以蒸餾水為瓶插液,處理組用100 μmol·L-1SNP為瓶插液,將其置于常溫、漫射光試驗臺上,每日觀察記錄。

    對照組 (CK)。將其中18枝平均放入3個盛有等量蒸餾水的瓶中,每瓶6枝,編號分別為CK1,CK2和 CK3。

    處理組。將另外18枝平均放入3個盛有等量100 μmol·L-1SNP的瓶中,每瓶6枝,編號分別為 T1,T2,T3。

    1.3.3 測定時間段

    根據(jù)開花級數(shù)通行標準,從蕾期至萎蔫劃分為6級:0級,花萼抱合直立;1級,花萼開展至水平;2級,花瓣開始松散;3級,花瓣初開,外層花瓣展開;4級,盛開,多層花瓣展開;5級,盛末,花瓣全開花朵露心;6級,蔫初,花瓣翻卷或萎蔫。在第0天 (2~3級)、切花達到盛花期(3~4級,第3天)、開始衰敗期 (5級,第9天)、失去觀賞價值期 (6級,第13天)各取樣1次。

    1.3.4 測定指標

    SOD活性。測定部位為花瓣、花萼、花梗。

    在每個時間段測定時,從3個對照瓶中各取1枝,分別測定3個部位的上述指標,記錄數(shù)據(jù)。處理瓶測定方法同上。

    1.4 月季SOD提取液的制備

    取樣部位為花瓣、花萼、花梗,各部位樣品分別取0.6 g(精確到0.01 g)。為減小系統(tǒng)誤差,花瓣取樣采用先去除最外層花瓣,然后將剩余花瓣剪碎混勻稱取樣品;花萼同花瓣的取樣方法;花梗取的是距花托5~10 cm莖段,剪碎混勻取樣。其中邊取樣邊用液氮快速研磨,盡可能準確測定試驗指標。在每個時間段測定時,從3個對照瓶 (CK)和3個處理瓶 (T)中,每瓶取形態(tài)相近的花材1枝,統(tǒng)一剪取花瓣、花萼、花梗,用電子天平各準確稱0.6 g樣品 (精確到0.01 g),共18份。每份提取粗酶液時,將樣品放進冰浴預冷的研缽中,加液氮快速研磨成粉末,然后加3次pH值7.8的磷酸鹽緩沖液,每次加2 mL,再加少量2%的PVP快速碾磨成勻漿,完成后將樣品轉(zhuǎn)入到10 mL的離心管中,用2 mL磷酸緩沖液洗滌研缽,將洗液一并轉(zhuǎn)入離心管中,成對調(diào)節(jié)平衡后用冷凍離心機在4℃,12 000 g·min-1下離心20 min,上清液即為SOD提取液,將其轉(zhuǎn)入小試管中保存于4℃冰箱中備用。

    1.5 紫外分光光度法測定SOD活性

    1.5.1 紫外分光光度法

    利用NBT法測定。取小試管18支并編號,依次加入各酶液上清液50 μL和3 mL NBT反應液為樣品管。另取3支小試管,加入50 μL磷酸緩沖液和3 mL NBT溶液,2支用雙層黑紙?zhí)淄踩陶诠庾稣{(diào)零用,另1支作對照管,和樣品管一起在25℃下燈光照25 min(觀察顏色變化,不能太深)。測560 nm下吸光值 (D)。

    1.5.2 數(shù)據(jù)處理

    15 μL酶液+3 mL考馬斯亮藍,于595 nm下測月季可溶性蛋白D值。

    牛血清蛋白標準曲線作為蛋白標準曲線:Y=0.290 8X+0.004 6(Y為吸光值,X為蛋白質(zhì)含量),利用NBT光照還原紫外分光光度法將試驗測得的月季D值代入Y,求得X。

    月季可溶性蛋白質(zhì)含量:

    M(mg·g-1鮮重)=X·VT·FW-1·V-11。

    式中,VT為樣液總體積 (mL),V1為測定時樣品用量 (mL),F(xiàn)W為鮮重 (g)。

    SOD活性=(DCK-Df)VT(0.5DCK·0.6M·V1)-1。

    式中,DCK為照光對照管的光吸收值,Df為樣品管的光吸收值,VT為樣液總體積 (mL),V1為測定時樣品用量 (mL),M為1 g樣品中可溶性蛋白的含量。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 花瓣SOD活性的變化

    表1顯示,瓶插前期,第0天 (復水后第1天)對照和處理花瓣SOD活性基本一致;第3天(切花達到盛花期)測定,SOD活性跟第0天相比,數(shù)值上升很多,說明瓶插前期,SOD活性值呈逐漸上升趨勢;第6天 (開始衰敗期)測定,SOD活性值有所下降,第9天 (失去觀賞價值期)測定,SOD活性值又下降一些。說明切花瓶插第3天,處于開花最佳時期時,SOD活性達到最大,第6天和第9天花開始衰敗和失去觀賞價值,SOD活性隨之下降;在整個瓶插過程中,花瓣SOD活性呈先升后降的趨勢。經(jīng)SNP處理的月季切花花瓣的SOD活性值明顯大于對照組。

    2.2 花萼SOD活性的變化

    表2顯示,瓶插前期,第0天 (復水后第1天)對照和處理花托SOD活性基本一致;第3天(切花達到盛花期)測定,與第1天相比,SOD活性上升很多,說明瓶插前期,SOD活性值呈逐漸上升趨勢;第6天 (開始衰敗期)測定,SOD活性值有所下降;第9天 (失去觀賞價值期)測定,SOD活性值又下降一些。說明切花瓶插第3天,處于開花最佳時期時,SOD活性達到最大,第6天和第9天花開始衰敗和失去觀賞價值,SOD活性隨之下降。在整個瓶插過程中,花瓣SOD活性呈先升后降的趨勢。而經(jīng)過SNP處理的月季切花花萼的SOD活性值明顯大于對照組。

    表1 不同時間NO對月季花瓣SOD活性的影響

    表2 不同時間NO對月季花萼SOD活性的影響

    2.3 花梗SOD活性的變化

    表3顯示,瓶插前期,第0天 (復水后第1天)對照和處理花彎莖SOD活性基本一致;第3天 (切花達到盛花期)測定,與第1天相比,SOD活性值上升很多,說明瓶插前期,SOD活性值呈逐漸上升趨勢;第6天 (開始衰敗期)測定,SOD活性值有所下降;第9天 (失去觀賞價值期)測定,SOD活性值又下降一些。說明切花瓶插第3天,處于開花最佳時期時,SOD活性達到最大,第6天和第9天花開始衰敗和失去觀賞價值,SOD活性隨之下降。在整個瓶插過程中,花瓣SOD活性呈先升后降的趨勢。經(jīng)SNP處理的月季切花花彎莖的SOD活性值明顯大于對照組。

    表3 不同時間NO對月季花梗SOD活性的影響

    綜上可知,月季切花在瓶插過程中,不同部位的SOD活性值均呈先迅速上升,達到最大值后逐漸下降的趨勢。月季切花瓶插前期,SOD活性迅速增強,表明切花吸水量增加,清除活性氧保護酶的活性提高,提高了清除活性氧的能力。瓶插后期隨著切花的蒸騰作用超過其吸水速率,花瓣中SOD和CAT活性下降,活性氧的產(chǎn)生與清除平衡系統(tǒng)受到破壞,導致膜脂過氧化加劇,MDA大量積累,質(zhì)膜損傷,透性增加,造成花朵衰老,最終死亡。

    試驗顯示,處理組SOD活性值高于對照組,說明NO有增強SOD活性的功能。張少穎等[9]首次將NO保鮮的研究用于月季切花,并獲得了預期的效果。此外,100 μmol·L-1SNP能降低月季切花各部位的萎蔫率,說明外源NO能夠延緩月季切花的衰老,延長瓶插壽命。

    3 小結(jié)和討論

    試驗通過用 100 μmol·L-1的外源 NO 供體SNP作為瓶插液對月季切花進行處理培養(yǎng),結(jié)果表明,不同測定時間的SOD活性均明顯高于對照組(蒸餾水處理)。可能NO通過某種途徑誘導了SOD抗氧化酶基因的表達,增強了其活性。有研究顯示,NO能誘導CAT和APX活性,并對CAT,SOD轉(zhuǎn)錄水平有影響[10]。100 μmol·L-1SNP 對鹽脅迫下白骨壤 (A.marina)葉片SOD活性的影響是通過非 cGMP 依賴途徑實現(xiàn)的[11]。Beligni等[10]發(fā)現(xiàn),GA可減少大麥糊粉層中CSOD的含量,而NO可延緩GA所引起的CAT和SOD的減少。目前,適當濃度的外源NO能提高植物抗逆性的論斷已基本上得到認同[12]。試驗證明,100 mol·L-1硝普鈉 (SNP)+干旱處理顯著提高了刺槐幼苗葉片的SOD 和 POD 活性[13]。劉建新等[14]研究也表明,100 μmol·L-1SNP顯著提高了幼苗葉片SOD含量。試驗研究確定了外源NO對月季采后SOD活性的影響,得出NO能增強SOD活性,延緩月季切花衰老,延長采后壽命的結(jié)論,對月季切花保鮮技術研究具有重要意義。但在外源NO保鮮技術如何運用到實際切花保鮮方面還有待進一步探索研究,期待月季切花采后保鮮乃至其他切花保鮮道路上的重大突破。

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