黃瓜低農藥殘留品種的外果皮組織解剖學特征比較分析

趙 文 秦智偉 吳 鵬 周秀艷

（東北農業(yè)大學園藝學院，農業(yè)部東北地區(qū)園藝作物生物學與種質創(chuàng)制重點實驗室，黑龍江省寒地蔬菜生物學重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150030）

黃瓜低農藥殘留品種的外果皮組織解剖學特征比較分析

趙 文 秦智偉*吳 鵬 周秀艷

（東北農業(yè)大學園藝學院，農業(yè)部東北地區(qū)園藝作物生物學與種質創(chuàng)制重點實驗室，黑龍江省寒地蔬菜生物學重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150030）

以黃瓜低農藥殘留品系D0351及其相對應的高農藥殘留品系D9320作為材料，在始收期分別噴施霜霉威和毒死蜱兩種農藥，對兩個品系外果皮細胞的形態(tài)、氣孔、葉綠體以及線粒體超微結構進行比較分析。結果表明：在自然狀態(tài)下，兩個品系的最大差異是外果皮細胞結構，D0351品系外果皮細胞呈長條形，D9320品系呈近正方形，D0351品系的外表皮細胞面積小于D9320品系。兩個品系經農藥處理后，D0351外果皮細胞變成近圓形或長圓形，D9320外果皮細胞形態(tài)沒有改變，兩個品系的外果皮細胞面積都增加，且D0351的細胞面積仍小于D9320；氣孔開口度D0351的增大程度比D9320??；兩個品系的葉綠體內的嗜鋨顆粒數量變多、體積變大；線粒體形態(tài)及內部結構沒有改變。

黃瓜；農藥殘留；外果皮；超微結構

黃瓜（Cucumis sativus L.）是設施園藝主要栽培的蔬菜作物之一，并且是世界上栽培面積最大的果菜類蔬菜（曲波 等，2003）。在農業(yè)生產的過程中極易受到病蟲害的侵襲，為了保證農產品的增產增收，施用農藥是避不可少的環(huán)節(jié)，隨之而產生的農藥殘留問題成為大家關注的焦點，但不適量的施用化學農藥不僅會影響到產品的安全品質及生態(tài)環(huán)境，同時也可能會影響植物的超微結構并破壞其正常的生理代謝過程。以往研究自然環(huán)境的變化，比如干旱、鹽漬、低溫、重金屬等對植物超微結構變化的影響較多（吳凱和周曉陽，2007；Gao et al.，2010；Liu et al.，2012；Trotta et al.，2012），但對植物受到化學農藥脅迫下的超微結構變化的報道比較少。

果實表皮的最外層是蠟質層，是與外界接觸的第一道防線，可以保護果實免受外界生物以及非生物的傷害，具有阻止水分非氣孔性的散失，減少大氣中有毒物質沉積和表面?zhèn)Φ茸饔?。蠟質的組分、含量、結構受到外界環(huán)境條件，如干旱、溫度、濕度、微生物、光照等環(huán)境的影響。農藥污染植物后，可滲透其表皮蠟質層或組織內部，進入到細胞中。有研究報道噴施氧化樂果、吡蟲啉、苦參堿對大葉黃楊的蠟質含量有影響，噴施農藥對表皮產生了脅迫，使蠟質含量降低，隨著時間的推移，這種脅迫效應消失（馬永亮 等，2006；李婧婧 等，2011）。低磷脅迫對甜菜根的生長發(fā)育有重要的影響（周建朝和奚紅光，2006），土壤農藥殘留物可以導致蠶豆根尖細胞微核及染色體畸變，隨著處理時間的延長，蠶豆根尖細胞微核率及染色體畸變率隨之增加，農藥殘留對細胞結構產生了很大的影響（李宏，2009）。

依據東北農業(yè)大學園藝學院黃瓜課題組前期工作基礎，已經篩選出農藥殘留量高低不同的品種，并初步確定了農藥殘留量高低的指標，建立了評價黃瓜種質資源農藥殘留性評價指標體系回歸方程（劉芳芳 等，2010）。低農藥殘留符合加性-顯性遺傳模型，受環(huán)境影響不大，是多基因控制的數量性狀，具有遺傳屬性（馬佰慧，2010）。所以本試驗選擇農藥殘留量高低差異顯著的兩個品系為試材，試圖通過對農藥脅迫后黃瓜外果皮超微結構變化的分析比較，探明低農藥殘留品種果皮解剖結構特征，為今后開展黃瓜低農藥殘留機理及遺傳育種研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取東北農業(yè)大學園藝學院黃瓜課題組已篩選出的低農藥殘留黃瓜品系D0351，高農藥殘留黃瓜品系D9320作為研究對象（劉芳芳 等，2010），種子均由黃瓜課題組提供。

1.2 試驗處理

試驗于2012年4～7月在東北農業(yè)大學園藝試驗站黃瓜課題組陽光棚中進行，小區(qū)設計采用隨機區(qū)組法，品種栽培按照當地正常栽培管理進行，做到肥、水、光照、溫度供給一致。

1.2.1 農藥噴施方法 試驗噴施兩種農藥，霜霉威（Propamocarb）用來防治黃瓜霜霉??；毒死蜱（Chlorpyrifos）主要防治黃瓜蟲害。根據農藥說明書上推薦的稀釋倍數，配制72.2%霜霉威水劑400倍液，48%毒死蜱乳油800倍液，在植株始收期開始噴施農藥，將兩種化學農藥分別均勻地噴施于兩個品系的地上部，同時用水噴施黃瓜植株作為對照，共噴施3次，每隔5d 噴1次，在最后一次噴藥后5d取樣。

1.2.2 掃描電鏡樣品制備與觀察 選取長勢相同的對照和處理相同節(jié)位上的果實，取果實中部的外果皮組織用雙面刀片切成2mm×5mm的小條，迅速放入2.5%戊二醛（磷酸緩沖液配制）固定，抽氣至樣品沉淀，放置于4℃冰箱中固定1.5 h以上。吸去戊二醛，用0.1mol·L-1pH為6.8的磷酸緩沖液沖洗3次，每次10min，接著分別用濃度為50%、70%、90%乙醇進行梯度脫水，每次15min，100%乙醇脫水2次，每次15min。再用100%乙醇∶叔丁醇=1∶1，純叔丁醇各置換1次，每次15min，置于ES-2030（HITACHL）型冷凍干燥儀對樣品進行干燥，大約4 h；用導電膠帶粘在掃描電鏡樣品臺上，用E-1010（HITACHI）型離子濺射鍍膜儀在樣品表面鍍一層15 nm厚的金屬膜；最后在S-3400N掃描電鏡下觀察拍照。

1.2.3 透射電鏡樣品制備與觀察 同掃描電鏡相似，選取相同節(jié)位的果實，取果實中部的外果皮組織用雙面刀片切成3mm×1mm的小條，用2.5%戊二醛（磷酸緩沖液配制）固定，抽氣至樣品沉淀，放置于4℃冰箱中進行前固定并保存；吸去戊二醛，用pH6.8的磷酸緩沖液沖洗3次，每次15min。在通風櫥中用2%四氧化鋨固定3.5 h，再次用pH6.8的磷酸緩沖液沖洗3次，每次15min。接著分別用濃度為50%、70%、90%乙醇進行梯度脫水，每次15min，100%乙醇脫水2次，每次10min。再用100%乙醇∶丙酮=1∶1置換1次，10min；100%丙酮置換1次，5min。用純丙酮∶環(huán)氧樹脂812包埋劑=1∶1包埋40min，再加入1份環(huán)氧樹脂812包埋劑包埋2 h，再加入1份環(huán)氧樹脂812包埋劑開蓋過夜。將樣品置于恒溫箱中聚合，磨塊后用ULTRACUTE型切片機進行切片，厚度為50～70 nm。經醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛分別對樣品染色，在JEM21200EX型透射電鏡下觀察并拍照。

2 結果與分析

2.1 黃瓜低農藥殘留品系D0351和高農藥殘留品系D9320果實的外部形態(tài)

黃瓜低農藥殘留品系D0351果實的外果皮呈現黃白色，帶有刺瘤，刺瘤堅硬，果實縱徑14.79cm，橫徑6.31cm，而高農藥殘留品系D9320果實的外果皮呈現淺綠色，帶有刺瘤，果實縱徑25.46cm，橫徑5.78cm。

2.2 黃瓜低農藥殘留品系D0351和高農藥殘留品系D9320在兩種農藥處理下外果皮細胞結構

未經農藥處理的低農藥殘留品系D0351外果皮細胞為長條形（圖1-1）；毒死蜱處理后外果皮細胞變成了近圓形（圖1-2）；霜霉威處理后外果皮細胞由長條形變成長圓形，長度變小，寬度未發(fā)生變化（圖1-3）；兩種農藥處理相比較表明農藥種類的差異對外果皮細胞變化的影響是不同的，說明不同種類農藥作用植株的方式是不同的。

未經農藥處理的黃瓜高農藥殘留品系D9320外果皮細胞為近正方形（圖1-4）；毒死蜱和霜霉威處理后外果皮細胞形狀沒有變化，但細胞的面積都增大，毒死蜱處理后外果皮細胞的面積增加幅度比霜霉威處理的?。▓D1-5、1-6）；說明霜霉威處理對植株外果皮細胞的作用力大。

未經農藥處理的品系D0351與D9320的外果皮細胞結構分別為長條形與近正方形，差異顯著，表皮細胞形態(tài)的差異是導致農藥殘留量高低的解剖學特征之一。

毒死蜱處理的兩個品系的外果皮細胞的形狀及面積都不同，并且細胞面積D0351比D9320的小。

霜霉威處理的兩個品系的外果皮細胞的形狀及面積都不同，D0351外果皮細胞的形狀為長圓形，D9320的形狀是近正方形，D0351的外果皮細胞面積小于D9320品系。

2.3 黃瓜低農藥殘留品系D0351和高農藥殘留品系D9320在兩種農藥處理下的氣孔結構

未經農藥處理的D0351氣孔是由兩個保衛(wèi)細胞組成的腎形結構，嵌入外果皮上（圖2-1）；兩種農藥處理下的D0351氣孔組成方式沒有改變，都是由兩個保衛(wèi)細胞組成的腎形結構；毒死蜱處理的D0351氣孔近似于圓形，氣孔下陷的現象消失，氣孔的開口度變大（圖2-2）；霜霉威處理的D0351氣孔橢圓形，下陷消失，氣孔整體變大，氣孔的開口度變大（圖2-3）。

圖1 D0351品系與D9320品系不同處理下外果皮細胞的結構

圖2 D0351品系與D9320品系不同處理下氣孔的特征

未經農藥處理的D9320氣孔是由兩個保衛(wèi)細胞組成的腎形結構，嵌入外果皮上（圖2-4），毒死蜱農藥處理的D9320的氣孔組成與未經農藥處理相同，氣孔變大，開口度變大（圖2-5）；霜霉威處理的D9320氣孔變大，開口度變大（圖2-6）；霜霉威處理比毒死蜱處理的氣孔開口度變化大。

未經農藥處理的D0351與D9320兩個品系氣孔都是由兩個保衛(wèi)細胞組成的腎形結構，D0351品系比D9320品系氣孔在外果皮嵌入得深，氣孔大小相近，D0351品系氣孔開口度小于D9320品系。

毒死蜱處理后的兩個品系的氣孔和開口度都發(fā)生了變化，氣孔的長寬比變小，但氣孔的開口度變大，D0351品系的變化程度比D9320品系小，D0351品系的氣孔在外果皮的下陷消失，D9320品系的氣孔在外果皮的下陷程度加重。

霜霉威處理后的兩個品系的氣孔和開口度都發(fā)生變化，氣孔的長寬比變小，氣孔的開口度變大，D9320品系的變化程度比D0351品系顯著。

未經農藥處理的兩個品系氣孔形態(tài)、大小基本相同，噴施農藥后由于氣孔開口度大小的變化，導致兩個品系的殘留量發(fā)生了變化。因此，黃瓜品種外果皮氣孔的大小和開張程度的變化是農藥殘留量高低的一個重要的解剖學指標。

2.4 黃瓜低農藥殘留品系D0351和高農藥殘留品系D9320在兩種農藥處理下的葉綠體結構

未經農藥處理的D0351品系的葉綠體橢圓形，膜系統(tǒng)完整，基粒片層結構清晰可見，排列整齊，方向與葉綠體長軸平行，葉綠體內含有橢圓形的淀粉粒，嗜鋨顆粒圓形（圖3-1）；毒死蜱和霜霉威兩種農藥處理后D0351品系的葉綠體形態(tài)及內部結構均沒有改變，毒死蜱農藥處理的嗜鋨顆粒變多，體積增大（圖3-2）；霜霉威處理下嗜鋨顆粒體積略變大（圖3-3）。

圖3 D0351品系和D9320品系不同處理下葉綠體的結構

未經農藥處理的高農藥殘留黃瓜品系D9320葉綠體梭形，葉綠體膜系統(tǒng)清晰可見且有完整的膜系統(tǒng)，基粒片層結構清晰并與葉綠體長軸方向平行，淀粉粒橢圓形在葉綠體內部，嗜鋨顆粒圓形，比較小（圖3-4）；經過兩種農藥處理后，嗜鋨顆粒數量變多，體積變大（圖3-5、3-6）。

未經農藥處理的兩個品系的葉綠體在形狀上有細微的差異，內部結構并沒有差異。

毒死蜱處理的D0351品系的嗜鋨顆粒體積比D9320品系的大。

霜霉威處理的兩個品系葉綠體形態(tài)結構及內部組成沒有差異。

2.5 黃瓜低農藥殘留品系D0351和高農藥殘留品系D9320在兩種農藥處理下線粒體解剖學特征

兩個品系無論是否經過農藥的處理，農藥的種類是否相同，線粒體的結構特征都沒有發(fā)生變化，雙層膜結構清晰可見，膜系統(tǒng)完整，內部嵴無規(guī)則排列（圖4-1～4-6）。

圖4 D0351品系與D9320品系不同處理下線粒體結構

3 結論與討論

低農藥殘留黃瓜品系D0351與高農藥殘留黃瓜品系D9320的外果皮細胞在自然狀態(tài)下形態(tài)有顯著的差異，低農藥殘留品系D0351的外果皮細胞呈長條形，而高農藥殘留品系D9320的外果皮細胞呈近正方形。細胞大小的差異導致細胞對環(huán)境中的懸浮物及其他化學物質的接觸面積和吸收量不同，外果皮細胞在形態(tài)上的差異是比較兩個黃瓜品系農藥殘留量高低的一個指標。噴施化學農藥后，通過表皮細胞形態(tài)變化改變了農藥在植株體內的殘留量，細胞形態(tài)變化大，對農藥的抵抗作用強。兩種農藥噴施于植株果實上，細胞表面的微環(huán)境發(fā)生變化，影響了細胞結構變化，導致生理代謝異常（張清智 等，2008）；無論是哪種農藥處理，低農藥殘留品系D0351的外果皮細胞面積均小于高農藥殘留品系D9320。

自然狀態(tài)下D0351氣孔開口度小于D9320；經過農藥處理后，D0351品系氣孔開張程度比D9320品系變化小。氣孔是植株進行氣體交換最重要的器官，噴施農藥后農藥通過氣孔進入植株體內，所以當氣孔開口度比較大時，農藥進入植株體內的量較多，這也是D0351品系農藥殘留量比D9320品系低的原因之一，接觸農藥后D0351品系的氣孔開口度也很小，在組織結構上阻止藥液進入。因此，黃瓜外果皮氣孔大小及開口度變化的程度可以作為低農藥殘留的一個重要的解剖學指標。

兩個品系果實的外部形態(tài)及農藥殘留量都有很大的差異，但葉綠體的形態(tài)及內部結構相同，葉綠體都能正常進行光合作用，提供植株生長必要的養(yǎng)料，所以葉綠體不能作為評價殘留量高低的解剖學特征。噴施農藥量過大，植株葉片邊緣出現白斑，葉片變硬，葉綠體內嗜鋨顆粒數量及體積增大，加速植株正常的代謝，是植株衰老的一個標志（王志坤 等，2007）。

線粒體是為植株生長提供能量的場所，兩個農藥殘留量不同的黃瓜品系線粒體的結構相同，線粒體的功能相同；當噴施了兩種不同類型的農藥后，線粒體沒有發(fā)生變化，說明線粒體對化學農藥的毒害有一定的抗性，或者化學農藥的殘留量不足以引起線粒體的傷害。

低農藥殘留品種D0351外果皮細胞形狀呈長條形、細胞面積小、氣孔的開口度小是導致植株農藥殘留量低的重要解剖學特征?；瘜W農藥對植株的解剖結構有一定的影響，毒死蜱和霜霉威處理的外果皮細胞、氣孔及葉綠體中嗜鋨顆粒發(fā)生了改變，低農藥殘留品種對化學農藥引起的變化抵御能力比較強。噴施高濃度天王星處理棉花葉片，對葉肉細胞、葉綠體、線粒體都有一定的毒害作用（郭明和李志軍，2000）。這種變化是由藥害作用引起，還是由植物本身作用仍需要進一步的研究。至于農藥影響植物的超微結構并破壞正常的生理代謝過程的作用機理、作用方式等深層次原因有待進一步的探討研究。

郭明，李志軍.2000.天王星對棉株葉組織超微結構的影響.應用與環(huán)境生物學報，6（6）：530-534.

李宏.2009.土壤農藥殘留物對蠶豆根尖細胞微核及染色體畸變的影響.貴州農業(yè)科學，37（4）：182-183.

李婧婧，黃俊華，謝樹成.2011.植物蠟質及其與環(huán)境的關系.生態(tài)學報，31（2）：565-574.

劉芳芳，秦智偉，周秀艷.2010.低農藥殘留量的黃瓜種質資源篩選.東北農業(yè)大學學報，41（7）：32-36.

馬佰慧.2010.黃瓜果實霜霉威殘留性的遺傳分析與SSR分子標記.哈爾濱：東北農業(yè)大學.

馬永亮，楊玉武，劉立杰，曲愛軍.2006.氧化樂果、吡蟲啉和苦參堿對大葉黃楊蠟質層含量的影響.林業(yè)科技，（1）：19-20.

曲波，李寶聚，范海延，朱延姝.2003.黃瓜病害發(fā)展新趨勢與無公害防治策略.北方園藝，（5） ：7-8.

王志坤，秦智偉，李艷秋，周秀艷.2007.黃瓜果實衰老過程中果皮超微結構的變化.園藝學報，34（4）：889-894.

吳凱，周曉陽.2007.環(huán)境脅迫對植物超微結構的影響.山東林業(yè)科技，（3）：80-83.

張清智，陳振德，王文嬌，劉紅玉.2008.毒死蜱脅迫對小白菜抗氧化酶活性和相關生理指標的影響.生態(tài)學報，28（9）：4524-4530.

周建朝，奚紅光.2006.不同基因型甜菜根形態(tài)和解剖學研究.中國甜菜糖業(yè)，（4）：2-4.

Gao Yang，Guo Yan-Kui，Lin Shao-Hang，Fang Ye-Ying，Bai Ji-Gang.2010.Hydrogen peroxide pretreatment alters the activity of antioxidant enzymes and protects chloroplast ultrastructure in heat-stressed cucumber leaves. Scientia Horticulturae，126（1）：20-26.

Liu Yubing，Li Xinrong，Liumeiling，Cao Bo，Tan Huijuan，Wang Jin，Li Xiaojun.2012.Responses of threedifferent ecotypes of reed （Phragmites communis Trin.） to their natural habitats：leaf surfacemicro-morphology，anatomy，chloroplast ultrastructure and physio-chemical characteristics.Plant Physiology and Biochemistry，51：159-167.

Trotta A，Redondo-Gómez S ，Pagliano C，Clementem E F，Rascio N，La Rocca N，Antonacci A，Andreucci F，Barbato R.2012.Chloroplast ultrastructure and thylakoid polypeptide composition are affected bydifferent salt concentrations in the halophytic plant Arthrocnemummacrostachyum.Journal of Plant Physiology，169：111-116.

Comparative Analysis of Epicarp Tissue Anatomical in Low Pesticide Residue Cucumber Strain

ZHAO Wen，QIN Zhi-wei*，WU Peng，ZHOU Xiu-yan
（College of Horticulture，Northeast Agricultural University，Key Laboratory of Biology andgenetic Improvement of Horticultural Crops（Northeast region），Ministry of Agriculture，Key Laboratory of Cold Area Vegetable Biology，Harbin150030，Heilongjiang，China）

The low pesticide residue cucumber（Cucumis sativus L.）strain（D0351）and the high pesticide residue strain（D9320）were taken as testedmaterials.Chlorpyrifos and propamocarb pesticide were sprayed on cucumber plants in harvest beginning stage.The epicarp cellsmorphology，stoma，chloroplast andmitochondria ultra-structure of these2 strains were compared.The result indicated that the biggestdifference between these2 strains was the structure of the epicarp cells.The epicarp cell of straind0351 was elongated，while that of straind9320 was foursquare.The outer area of the epicarp cell ofd0351was smaller than that ofd9320.After pesticide sprayed treatment，the epicarp cells of the straind0351 became round or oblong，and the epicarpmorphology of straind0351 was changed，while that of straind9320 was not changed.The epicarp cell areas of both strains were increased.As for the stoma openingdegree the straind9320 is bigger than strainsd0351.The number of osmium particle of both strains were increased and their sizes became larger in the chloroplast.Mitochondrialmorphology and internal structure was not changed.

Cucumber；Pesticide residue；Epicarp；Ultrastructure

S642.2

A

1000-6346（2013）20-0032-07

2013-03-16；接受日期：2013-05-17

國家自然科學基金項目（31272158），國家科技計劃“863”課題（2012AA100105）

趙文，女，碩士研究生，專業(yè)方向：黃瓜遺傳育種，E-mail：zhaowenxingfu@163.com

*通訊作者（Corresponding author）：秦智偉，男，教授，博士生導師，專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種，E-mail：qzw303@126.com