漆酶最佳固定化條件研究

張 佳 張安龍 景立明

(1.包頭市核新環(huán)保技術有限責任公司，內蒙古包頭，014000;2.陜西科技大學，陜西西安，710021)

一級沉降、二級生化處理是目前降解造紙廢水比較成熟的技術，可在一定程度上大幅度降低造紙廢水的污染負荷［1］，但隨著制漿造紙廢水排放指標的不斷嚴格，一二級處理已不能滿足廢水出水水質要求，因此廢水的深度處理逐漸成為研究的熱點［2］。漆酶是含有4個銅離子的多酚類單電子氧化酶，可以氧化如氯代酚、多氯聯(lián)酚、二氯苯胺、殺蟲劑、染料等芳香族化合物，在漆酶介體 (HBT等)存在下，漆酶還可以催化降解與木素相關的二苯基甲烷及二惡英等［3-5］。因此漆酶被廣泛應用于食品加工、造紙、皮革等工業(yè)領域，尤其是在造紙廢水的木素脫除過程中發(fā)揮著重要的作用。但是酶一旦從細胞中分離出來，其活性會迅速下降，并且在實際應用中對外界環(huán)境的變化非常敏感，因此限制了漆酶的廣泛使用。張安龍等人［6］采用明膠對漆酶進行固定化，固定后的漆酶用于深度處理麥草漿造紙廢水，在最佳反應條件下，廢水色度去除率達70%，COD去除率在65%以上。本實驗采用環(huán)氧化聚乙烯醇 (PVA)載體對漆酶進行固定化，確定了漆酶固定化的最佳工藝條件，以酶活來反映固定化效果，以色度去除率反映固定化漆酶的工程應用可行性。

1 實驗

1.1 水樣特性

水樣取自奧輝紙業(yè)燒堿法麥草漿制漿的二沉池出水，指標為:pH 值 6.9 ～7.8，CODCr為 230 mg/L，BOD5為33.6 mg/L，可生化性 (BOD/COD)為0.15。

1.2 實驗儀器及藥品

UV759紫外可見分光光度計;水浴恒溫振蕩器;數(shù)字式酸度儀;BODTrakTM型BOD測試儀，HACH公司;光照培養(yǎng)箱。

游離漆酶，購買于某生物公司成品粗酶;聚乙烯醇 (PVA);戊二醛;環(huán)氧氯丙烷;二甲基亞砜;愈創(chuàng)木酚;丁二酸;磷鉬雜多酸。以上藥品均為分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1 環(huán)氧化PVA的制備

配置質量分數(shù)為10%的PVA水溶液。稱取100 g PVA水溶液，加入35 mL、體積分數(shù)為25%的戊二醛，混合均勻，用HCl調節(jié)PVA水溶液pH值為1～2，20℃下攪拌均勻，成凝膠狀后將其放入60℃水浴中反應3 h。反應結束后將塊狀凝膠打碎成顆粒狀，粒狀PVA經(jīng)丙酮洗、水洗，過濾后稱取10.0 g PVA顆粒，加入10.0 mL環(huán)氧氯丙烷和10.0 mL二甲基亞砜溶劑，以NaOH為催化劑，控制反應pH值為11～12，反應一定時間后用2 mol/L的HCl滴定至中性，再用丙酮與清水洗凈后得到固定化載體——環(huán)氧化PVA。環(huán)氧化反應主要方程式見式 (1)［7］。

1.3.2 漆酶的固定化

稱取5 g環(huán)氧化PVA載體，加入一定量液態(tài)漆酶和10 mL pH值一定的HAc-NaAc緩沖溶液，35℃水浴中以150 r/min轉速振蕩一定時間后獲得固定化漆酶，用緩沖溶液洗滌至洗出液中無酶蛋白，4℃下保存。漆酶固定化原理見式 (2)。

1.4 分析方法

1.4.1 固定化漆酶酶活的測定

底物的配制:將137.4 μL愈創(chuàng)木酚 (分析純)和4.5 g丁二酸加入800 mL蒸餾水中，用NaOH溶液調節(jié)pH值至4.5，用蒸餾水定容至1 L。

取4 mL底物于試管中，加入1 g固定化漆酶，混合均勻后于30℃水浴反應30 min，測定其在波長465 nm下吸光度 (OD465)值。對照管中加1 g未固定化漆酶的環(huán)氧化PVA載體和4 mL底物。酶活計算公式如式 (3)所示，定義1 min內轉化1 μmol底物所需的固定化漆酶量為1個漆酶活力單位 (U/g)［8］:

式中，ε465(愈創(chuàng)木酚)=1.21 × 104L/(mol·cm);Δt為酶反應時間，min;ΔOD為吸光度的變化值;V為比色皿中溶液的總體積，mL;m為參加反應的固定化漆酶的質量，g;N為酶液稀釋倍數(shù);L為比色皿光徑，cm。

在漆酶固定化條件的優(yōu)化實驗過程中，使用相對酶活的概念，即在優(yōu)化某個條件的各水平梯度實驗中，將最優(yōu)條件下的酶活作為100%，其他水平梯度的酶活為相對于100%酶活的活性［9］。

1.4.2 色度去除率的測定

色度去除率的測定采用紫外分光光度法，調節(jié)廢水pH值為7.6，用蒸餾水或者去離子水作對照，測定其在波長465 nm下的吸光度值［10］。在濃度較低時廢水的色度與其最大吸收波長的吸光度值成正比，可以用廢水在該處的吸光度變化來反映廢水色度的變化。色度去除率 (F)的計算公式見式(4)。

式中，A0表示初始時刻廢水在特征波長處的吸光度值;A表示 t時刻廢水在特征波長處的吸光度值。

2 結果與討論

2.1 漆酶用量對固定化效果的影響

取1.0 g環(huán)氧化PVA載體，分別加入不同用量的液態(tài)漆酶和HAc-NaAc緩沖溶液，用量如表1所示，通過相對酶活的大小來確定漆酶最佳用量。

由表1可知，當環(huán)氧化PVA載體用量與漆酶用量的比值為1∶1時可以得到相對酶活較高的固定化漆酶，由于在此過程中同時改變了緩沖溶液的用量，因此下一步繼續(xù)討論緩沖溶液用量對固定化效果的影響。

表1 漆酶用量對酶活的影響

2.2 緩沖溶液用量對固定化效果的影響

取5份環(huán)氧化PVA載體各5.0 g，分別加入0、2.5、5.0、7.5、10.0 mL HAc-NaAc 緩沖溶液，然后分別向每份環(huán)氧化PVA載體中加入5.0 mL漆酶，放入35℃水浴恒溫振蕩器中振蕩4 h，得固定化漆酶，測定不同緩沖溶液用量條件下得到的固定化漆酶的相對酶活，得出緩沖溶液用量與相對酶活的變化曲線如圖1所示。

圖1 緩沖溶液用量對酶活的影響

由圖1可以看出，當緩沖溶液用量大于等于5.0 mL時，得到的固定化漆酶相對酶活較高，繼續(xù)增大緩沖溶液用量幾乎對酶活沒有影響。由于固定化過程一直處于恒溫環(huán)境，所以溫度對酶活的影響可以不考慮。下面主要研究不同反應時間所對應的pH值變化情況，通過pH值的變化趨勢找出影響固定化漆酶酶活的原因。

通過全程監(jiān)測pH值變化情況，得到pH值隨反應時間變化曲線如圖2所示。從圖2可以看出，當緩沖溶液用量較少時，體系的pH值在反應時間內發(fā)生了很大變化，結合圖1可說明影響相對酶活大小的因素為體系pH值的變化。從圖2可以看出，當緩沖溶液用量為7.5 mL或10.0 mL時，反應體系的pH值在反應期間能維持在某一固定值，使得相對酶活較高。從圖2亦可看出，當pH值為4.0左右時，相對酶活較高。為保持反應所需的最佳pH值，確定緩沖溶液的用量控制在10.0 mL，使可獲得最佳的固定化效果。

圖2 不同反應時間下pH值的變化趨勢

2.3 固定化時間對漆酶活性的影響

分別稱取5.0 g環(huán)氧化PVA載體5份，每份加入5.0 mL 漆酶、10.0 mL pH 值 4.0 的 HAc-NaAc緩沖溶液，35℃下分別振蕩2、3、4、5、6 h，測定不同振蕩時間下漆酶的活性，得固定化漆酶的相對酶活隨時間變化曲線如圖3所示。

圖3 固定化時間對漆酶活性的影響

由圖3可知，當固定化時間為5 h時得到的固定化漆酶相對酶活最高。分析其原因可能為載體本身的環(huán)氧固載量決定了所能固定的漆酶的量。反應初始，漆酶逐漸固定到載體上，但隨著時間的繼續(xù)延長，一方面環(huán)氧固載量有限，不能固定更多的漆酶;另一方面，漆酶在不同溫度下具有不同的熱穩(wěn)定性，在35℃下保溫超過一定時間會導致部分酶活損失，所以本實驗確定漆酶的最佳固定化時間為5 h。通過接下來的實驗來驗證保溫時間和固定化溫度對酶活的影響程度，亦即漆酶的熱穩(wěn)定性。

2.4 保溫時間對漆酶活性的影響

將酶液在25、35、45、55、65、75℃下保溫一定時間，測定不同保溫時間下漆酶的剩余活性。以未經(jīng)保溫的漆酶酶活為100%，得不同溫度下漆酶的相對酶活隨保溫時間的變化曲線如圖4所示。

由圖4可以看出，隨著保溫時間的延長，漆酶的活性都呈下降趨勢，只是對于不同的溫度，其酶活下降的幅度有所不同。因此可以認為當溫度低于35℃時，漆酶能夠維持相對較高的漆酶活性。

2.5 固定化溫度對固定化漆酶活性的影響

取10.0 g PVA顆粒，加入10.0 mL環(huán)氧氯丙烷和10.0 mL二甲基亞砜，分別在20、30、35、40、50、60℃下固定化4 h，得固定化漆酶相對酶活隨溫度變化曲線如圖5所示。

由圖5可知，酶活受溫度影響很大，在較低的溫度范圍內酶活隨溫度的升高而升高，但超過35℃時酶活開始下降。分析原因為漆酶的化學本質為蛋白質，溫度過高導致蛋白質變性，漆酶失活，因此高的固定化溫度會導致漆酶失活，而較低的溫度又會影響催化活性，從而降低固定化漆酶的相對活性。綜合考慮，本實驗確定最佳固定化溫度為35℃。

表2 固定化漆酶對廢水色度的去除

3 固定化漆酶深度處理草漿中段廢水二沉池出水

本實驗取1 L奧輝紙業(yè)燒堿法麥草漿制漿二沉池出水，CODCr為230 mg/L，BOD5為33.6 mg/L，加入1.5 g固定化漆酶、5 mg磷鉬雜多酸介體、5 mg Cu2+，在室溫 (16℃左右)條件下曝氣反應6 h，控制反應體系的pH值分別為4.0和6.5，測定不同pH值反應條件下固定化漆酶對色度去除率的影響，結果如表2所示。

由表2可知，用該固定化漆酶處理草漿二沉池出水，當反應體系pH值為4.0時，其色度去除率可達62.9%，且 BOD5從初始的 33.6 mg/L 提升到49.6 mg/L，提高了47.6%，CODCr從 230 mg/L 降低為215 mg/L，廢水可生化性由0.15提高到0.23。固定化漆酶處理過的廢水再經(jīng)曝氣生物濾池或其他生物方法進行處理，可在一定程度上降低出水CODCr濃度和色度。

4 實驗發(fā)現(xiàn)的問題

該實驗獲得的固定化漆酶對CODCr的去除效果不是很明顯，并且在放置36 h后，酶活即達到相對酶活的1/2以下，不再具備降解能力，因此接下來的實驗需進一步分析影響固定化漆酶難以降低CODCr的因素，從而研究出最佳的漆酶固定化條件，使廢水的各個指標均達標排放，提高該固定化漆酶的實用性和環(huán)保性。抑或研究固定化漆酶對廢水可生化性的改變能力，通過與其他生物方法的結合達到深度處理廢水的目的。

該實驗在固定化漆酶反應過程中給予一定的曝氣量，使固定化漆酶處于懸浮狀態(tài)，可以通過吹脫的方式去除一部分沉積在固定化漆酶表面的木素，但隨著反應時間的延長，木素始終會覆蓋到固定化漆酶的表面上，導致酶活不能很好地發(fā)揮。接下來研究重點可以轉向固定化漆酶表面木素的去除方面。

5 結論

5.1 將漆酶進行固定化，是降低漆酶處理廢水成本的關鍵，以聚乙烯醇 (PVA)為載體固定化漆酶，得到最佳固定化條件為:固定化溫度T=35℃，反應pH值4.0，環(huán)氧化 PVA載體 (g)、漆酶 (mL)和HAc-NaAc緩沖溶液 (mL)的投加比例為1∶1∶2的條件下獲得的固定化漆酶具有較高的酶活。

5.2 固定化漆酶處理麥草漿制漿二沉池出水，在反應體系pH值4.0、反應6 h后，廢水的BOD增大了47.6%，可生化性得到提高，色度去除率達62.9%。5.3 該方法合成的固定化漆酶在放置36 h后酶活即達到相對酶活的1/2以下，不再具備降解能力。

［1］Li Songli，Hong Wei，Yang Haitao，et al.Advanced Treatment Technology of Papermaking Comprehensive Wastewater［J］.China Pulp ＆Paper，2006，25(6):71.

李松禮，洪 衛(wèi)，楊海濤，等.制漿造紙綜合廢水深度處理技術［J］.中國造紙，2006，25(6):71.

［2］Hong Wei，F(xiàn)eng Xiao-jing，Jiang Wen-qiang.Research on advanced treatment of papermaking wastewater［J］.China Pulp ＆ Paper，2006，25(2):65.

洪 衛(wèi)，馮曉靜，蔣文強.造紙中段廢水深度處理的研究［J］.中國造紙，2006，25(2):65.

［3］Yaropolov A I，Skorobogat’ko O V，Vartanov S S，et al.Laccase:properties，catalytic mechanism，and applicability［J］.Appl.Biochen.Biotechnol，1994，49:257.

［4］Nelson Duran，Elisa Espsito.Potential applications of oxidative enzymes and pH值enoloxidase like compounds in wastewater and soil treatment:a review［J］.Applied Catalysis B:Environment，2000，28:83.

［5］Li Kai-chang，Xu Feng，Karl Erik L，et al.Comparison of fugal laccases and redox mediators in oxidation of nonphenolic lignin model compound［J］.Applied and Environmental Microbiology，1999，65:2654.

［6］Zhang Anlong，Pan Hongyan.Research on Advanced Treatment of Wheat Straw Pulp Wastewater by Immobilized Laccase［J］.Environment Science and Technology，2010，33(12):274.

張安龍，潘洪燕.固定化漆酶深度處理麥草漿造紙廢水的研究［J］.環(huán)境科學與技術，2010，33(12):274.

［7］Xu Jiankuan，Yuan Zhi，He Binglin.The Preparation of Crosslinked Ploy(Vinyl Alcohol)Bead with Epoxy Group［J］.Ion Exchange and Adsorption，2002，18(1):64.

徐建寬，袁 直，何炳林.環(huán)氧化交聯(lián)聚乙烯醇球的制備［J］.離子交換與吸附，2002，18(1):64.

［8］Zhao Liangliang，Chen Bin，Li Yanrong，et al.Enzymology Characteristics of Constitutive Form Laccase Derived from Ganoderma Lucidum［J］.Northern Horticulture，2010(5):138.

趙亮亮，諶 斌，李燕榮，等.紅芝組成型漆酶酶學性質的研究［J］.北方園藝，2010(5):138.

［9］Zhao Min，Meng Qinghui，Wang Yan，et al.Synthesis of Crosslinked Polythylene Glycol Diacrylates and Their Application as Supports for Laccase Immobilization［J］.Transactions of China Pulp and Paper，2009，24(3):61.

趙 敏，孟慶輝，王 炎，等.交聯(lián)聚乙二醇二丙烯酸酯的制備及對漆酶的固定化研究［J］.中國造紙學報，2009，24(3):61.

［10］Kapdan，Kargi F.Effect of environmental conditions on biological decolorization of textile dyestuff by C.versocolor［J］.Enzyme and Microbial Technology，2000，26(5):381. CPP