利用液相色譜-二極管陣列-串聯(lián)質譜法結合化學計量學分析鑒別不同植物源的蜂蜜

■ 周金慧 李熠 吳黎明 陳蘭珍 薛曉鋒 張金振 陳芳 王鵬 黃京平 郭偉華 趙靜*

（作者周金慧、李熠、吳黎明、陳蘭珍、薛曉鋒、張金振、陳芳、王鵬、黃京平、郭偉華、趙靜單位為中國農業(yè)科學院蜜蜂研究所、農業(yè)部蜂產品質量監(jiān)督檢驗測試中心（北京）、農業(yè)部蜂產品質量安全風險評估實驗室）

蜂蜜是由蜜蜂采集植物的花蜜和蜜露通過與自身物質混合以后，釀造而成的天然甜味物質。蜂蜜含有葡萄糖、果糖、氨基酸、酶、礦物質、黃酮、酚酸等活性組分，另外還含有小部分的花粉和蜂蠟。多酚黃酮類化合物在植物中普遍存在，按結構可分為黃酮醇、黃酮類、二氫黃酮類、異黃酮、兒茶酚、花色素和查爾酮。這些化合物具有相同的基本骨架即含有15個C原子的C6-C3-C6結構，由兩個中間連有雜環(huán)吡喃或吡喃酮的苯環(huán)構成。黃酮類化合物的結構變化主要是由于羥基、氧原子和結合到環(huán)上的氫原子的數目和位置上存在差異產生的。這一類化合物能夠調節(jié)植物生長和發(fā)育，并且具有多種生物學作用如抗過敏，消炎殺菌，抗癌，防血栓和擴張血管活性。在這些研究中，黃酮類化合物可以作為金屬螯合劑和自由基清除劑來發(fā)揮抗氧化作用，通過抑制酶活性或螯合微量金屬元素來清除羥自由基。

許多方法利用黃酮類和多酚類化合物作為特征化合物對不同植物源的蜂蜜進行指紋圖譜分析，如高效液相色譜法(HPLC) ，氣相色譜法，配有不同檢測器的毛細管電泳法。結構上共軛雙鍵和芳香鍵的存在使得黃酮類化合物在紫外區(qū)280nm和360nm有較強的吸收。電子捕獲檢測器(ECD)在黃酮類化合物分析中具有很好的選擇性和靈敏度，其主要原理是基于對分析物在合適的電極庫倫陣列檢測器中發(fā)生的氧化/還原反應所產生的電流進行測定。在液相色譜-質譜聯(lián)用分析中，配備有電噴霧(ESI)或大氣壓化學電離源(APCI)能夠對待測的黃酮類化合物進行定性和定量分析，從而能夠提高方法的靈敏度和特異性?；谏V技術構建的指紋圖譜是對樣品進行質量控制和評價時，能夠反映化學成分組成的特征性指紋輪廓。由于天然物質的基質復雜性，指紋圖譜技術在分析樣品的鑒別和分類方面發(fā)揮著重要的作用?；瘜W計量學方法能夠從得到的化學測量數據中最大限度地提取有用的化學信息，其最大的特點是將多變量分析方法引入到了化學研究領域。近些年來在農產品的產地和植物源分析中得到了廣泛的應用。其中，主成分分析(PCA)，偏最小二乘法 (PLS)，偏最小二乘判別分析(PLS-DA)和簇類獨立軟模式法(SIMCA)廣泛應用于對模型復雜的化合物或生物學數據的建模和分析。

蜂蜜中的某些活性組分盡管含量較低但確是決定蜂蜜價格或等級的主要因素，而這些微量活性組分含量的差異是由蜜源植物決定的。市場上不同蜜源植物的蜂蜜價格不一樣，這也是導致蜂蜜造假的原因之一。本研究通過分析蜂蜜中黃酮類化合物的真實含量及其范圍，初步確定特征標識物，構建蜂蜜的指紋圖譜并提取化學計量學信息從而鑒別荊條蜜和油菜蜜。

實驗

1. 實驗材料

黃酮類化合物包含蘆丁(95%)、楊梅酮(96%)、槲皮素 (98%)、莰菲醇(97%)、芹菜素(95%)、松屬素(95%)、苛因(97%)、高良姜素 (95%)、桑色素(95%)、阿魏酸(99%)，柚皮素(98%) 和咖啡酸苯乙酯 (97%)。黃酮類化合物購買自sigma公司(St. Louis, MO, U.S.A.)。乙腈，甲醇和甲酸為HPLC級(DIMA Technology Inc, Richmond,U.S.A.)。鹽酸(37%)為分析純試劑，購買于北京化學試劑公司。Milli-Q純水(Bedford, MA, USA)。固相萃取(SPE)柱(Oasis HLB, 500mg/6mL)，(Milford, MA, USA)。

2. 標準溶液的制備

標準貯備液制備:分別用甲醇溶解黃酮類化合物標準品使其濃度范圍為0.1～0.8 mg/mL。混合中間溶液用甲醇按1:10稀釋原貯備液?；诒狙芯繖z測靈敏度和線性范圍配制標準工作溶液，現用現配。標準儲備液在-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?，混合中間溶液在2～6℃冰箱中保存。

HPLC-DAD條件：采用Agilent LC 1200系統(tǒng)(Agilent,Waldbronn, Germany) ，包括真空脫氣機(G1322A)、二元溶劑泵(G1312B)、自動進樣器(G1367D)、柱溫箱(G1316B)和二極管陣列檢測器(G1315C)，用來構建指紋圖譜。色譜分離采用Zorbax SB-C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm) (Agilent, Wilmington, DE)。黃酮類化合物溶液用二元梯度洗脫分離。流動相：A：純水，B：甲醇；梯度分離程序如下：0～15 min,10～25% (B); 15～20 min, 25～30% (B); 20～30 min, 30～35% (B); 30～35 min,35～70% (B); 35～40 min,等度洗脫進一步用5 min; 40～42 min, 70～10% (B); 42～50 min, 10%(B)。柱溫30℃；流速0.2 mL/min，進樣量5 μL。

3. 質譜條件

安捷倫6460三重四極桿串聯(lián)質譜，配有電噴霧離子源(ESI)接口和用來質譜分析和目標化合物量化的安捷倫射流離子聚焦(Agilent Technologies, Palo Alto, USA)。負離子方式檢測。調節(jié)參數使目標物分析條件最優(yōu)化：氣體溫度350℃，干燥氣流速 6 L min-1，霧化器壓力35 psi，毛細管電壓：3500 V，鞘流氣氣體溫度: 350 ℃，鞘流氣氣體流速: 9 L min-1,噴嘴電壓: 1000 V。表1顯示了黃酮類化合物母離子過渡到產物離子過程中采用的質譜參數。系統(tǒng)操作、數據獲取和分析均采用MassHunter軟件控制和處理。

表1. 12種黃酮類化合物的質譜參數

4. 樣品制備

2009年3月和9月之間從中國不同省份采集187個蜂蜜樣品，其中荊條蜜98個，油菜蜜89個。樣品避光室溫保存。分析前，若蜂蜜結晶，可以在恒溫水浴鍋不超過50℃條件下緩慢加熱融化。

稱取10 g 蜂蜜樣品于50 mL聚丙烯離心管中，30 mL純水混合，HCl調節(jié)pH到2，磁力攪拌器攪拌15 min至完全成為流體狀。然后10,000 rpm下離心10 min，去除雜質。上清液轉移到Oasis HLB固相萃取柱中上樣。萃取柱提前用10 mL甲醇，10 mL純水(HCl酸化，pH為2)活化。上樣后萃取柱用10 mL純水淋洗，吸附的黃酮類化合物用3 mL甲醇洗脫。洗脫液40℃下氮氣吹干濃縮。殘留物用1 mL的純水：乙腈 (70:30)復溶。之后樣品在漩渦儀混合2 min，用0.25 μm 微孔濾膜過濾，最后的溶液轉移到自動進樣小瓶，待HPLC-DAD-MS/MS分析。

黃酮類化合物的鑒定和分析采用安捷倫科技公司的MassHunter軟件。指紋圖譜和蜂蜜樣品的相似性用“中藥色譜指紋圖譜相似度評估系統(tǒng) ( 2004A 版本)”，該系統(tǒng)由國家食品藥品監(jiān)督管理局(SFDA)推薦，主要用于windows色譜相似度分析。多元分析包括PCA、PLS、PLS-DA 和SIMCA采用MATLAB 2009b軟件 (The Mathworks Inc., Natick, Mass., U.S.A.)。

結果和分析

1. 色譜條件

乙腈和甲醇作為流動相廣泛用于LC-MS/MS分析，因此可以通過調節(jié)流動相的比例來提高黃酮類化合物的分離度。和甲醇相比，使用乙腈作為流動相使黃酮類化合物具有更高的靈敏度和更尖銳的峰形狀。而甲醇作為流動相使黃酮類化合物色譜峰中有更好的分辨率。提高水相濃度或者降低乙腈含量能夠顯著地提高黃酮類化合物的保留能力和分辨率。黃酮類化合物有兩個紫外吸收波段：苯環(huán)結構的最大紫外吸收波長范圍為260～280 nm，肉桂酰結構的最大紫外吸收波長范圍為350～370 nm。所以，本研究分別在波長270 nm和360 nm處構建蜂蜜樣品中黃酮類化合物的指紋圖譜。

2. 質譜

根據文獻報道，黃酮類化合物在正離子和負離子模式下均能夠進行分析。全掃描質譜中，檢測質子化的和非質子化的12個黃酮類化合物的分子離子[M+H]+和[M-H]-來比較它們的豐度。在ESI電離源正離子模式條件下，除了楊梅酮外，其它黃酮類化合物都有較高響應值(圖1)。但是正離子化模式下，總離子色譜圖中一些目標物容易被其它化合物干擾并且楊梅酮無響應。所以在用質譜分析黃酮類化合物時，采用負離子ESI模式以得到相對穩(wěn)定和更佳的選擇性和靈敏度。

3. 樣品凈化步驟

圖1 12種黃酮類化合物在正離子和負離子模式下的總離子流圖。保留時間依次為阿魏酸(18.1), 柚皮素(19.3), 蘆丁(26.6),楊梅酮(28.3), 桑色素(30.6), 槲皮素(33.8), 莰菲醇(34.1), 柯茵(38.5), 松屬素(39.8), 芹菜素(44.1), 高良姜素(46.4)和咖啡酸苯乙酯(46.8)。

由于蜂蜜基質中含有大量的具有不同的理化性質的黃酮類化合物，因此，很難從中將黃酮類化合物完全分離出來。用酸性水溶液溶解蜂蜜并且使其中的蛋白質變性，從而從蜂蜜樣品中提取盡可能多的黃酮類化合物。沉淀下來的雜質和變性的蛋白質通過離心去除。上清液通過固相萃取柱過濾去除極性物質。在固相萃取柱洗脫實驗中，純水可以達到較好的淋洗效果，如果在純水中增加甲醇含量則導致黃酮類化合物回收率降低和指紋圖譜中色譜峰數量的減少。通過優(yōu)化實驗表明，10 mL純水和3 mL甲醇即可達到較好的洗滌和洗脫效果。

（未完待續(xù)）