常染色體顯性局灶節(jié)段腎小球硬化一家系INF2 基因及臨床特征

李國民 高學(xué)武 徐 虹 翟亦暉 沈 茜 張曉娥 方曉燕 安 宇 孫 利劉海梅 陳 徑 曹 琦 饒 佳

局灶節(jié)段腎小球硬化( FSGS) 是一種腎小球損傷的常見病理類型，以持續(xù)性腎病綜合征或非選擇性蛋白尿、高血壓、鏡下血尿和對糖皮質(zhì)激素耐藥為特點(diǎn)，可快速進(jìn)展為終末期腎病( ESRD)［1～3］。FSGS 分為家族性和散發(fā)性，家族性FSGS 又分為常染色體顯性( AD-FSGS) 和常染色體隱性( AR-FSGS) 。AR-FSGS 的主要致病基因?yàn)镹PHS2、NPHS1和PLCE1［4～10］。AD-FSGS 的 主 要 致 病 基 因 為 WT1、ACTN4、TRPC6 和INF2［11～16］，極少數(shù)由CD2AP 基因突變引起［17，18］。AD-FSGS 和AR-FSGS 致病基因在中國有散發(fā)性FSGS 病例的突變報(bào)道，但在家族性FSGS 研究中尚未見相關(guān)報(bào)道。本文以1 個中國AD-FSGS 家系為研究對象，對WT1、ACTN4、TRPC6 和INF2 基因進(jìn)行直接測序，總結(jié)ADFSGS 主要臨床特征、基因突變特點(diǎn)，提高對該病的認(rèn)識。

1 臨床資料

1.1 先證者 女，12 歲1 個月，因“體檢發(fā)現(xiàn)蛋白尿3 d”于2012 年5 月于復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院( 我院) 腎臟科就診。既往體健，無發(fā)熱、尿頻、尿急和尿痛，無水腫和少尿。腎功能檢查正常。肌電圖檢測正常。其父有類似病史并經(jīng)病理確診為FSGS。家族中無高血壓和糖尿病病史。鑒于體檢發(fā)現(xiàn)蛋白尿和其父FSGS 病史，懷疑FSCS 并進(jìn)一步行家系追蹤調(diào)查。

1.2 家系調(diào)查 本研究征得先證者家系所有成員或成員監(jiān)護(hù)人的書面同意，并經(jīng)過我院倫理委員會同意(2012032) 。圖1 顯示1 個上海地區(qū)4 代家系圖譜，先證者為Ⅳ6。家系成員間無近親婚配史。該家系共27 名成員，Ⅰ1、Ⅰ2、Ⅱ3、Ⅱ5 死因不詳，現(xiàn)有成員23 名，Ⅱ6、Ⅱ8、Ⅲ8、Ⅲ10 和Ⅳ6 為發(fā)病者。表1 顯示，5 例FSCS 患者中女性3例，男性2 例，平均發(fā)病年齡26.9 歲。均以蛋白尿起病。先后3 次對健在的家系成員進(jìn)行尿常規(guī)和尿微量蛋白檢測，18 例家族成員尿液分析未見異常；4 例( Ⅱ8、Ⅲ8、Ⅲ10和Ⅳ6) 尿液分析為蛋白尿，1 例( Ⅱ6) 因無尿未能進(jìn)行尿液分析。Ⅱ8、Ⅲ8 和Ⅲ10 曾在外院進(jìn)行腎組織活檢，Ⅱ8、Ⅲ8 病理檢查確診為FSGS，Ⅲ10 病理表現(xiàn)為局灶硬化伴系膜增殖。Ⅱ6 FSCS 發(fā)病10 年已進(jìn)展為ESRD。Ⅱ8、Ⅲ8 和Ⅲ10 曾在外院行肌電圖檢測均正常。發(fā)病者給予血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑/血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑( ACEI/ARB)治療，能減輕蛋白尿，未給予免疫抑制劑治療，2 例糖皮質(zhì)激素治療無效。

圖1 AD-FSGS 家系圖譜Fig 1 Pedigree of the AD-FSGS family

表1 家系中5 例AD-FSGS 患者臨床特征Tab 1 Clinical features of patients with AD-FSGS

1.3 診斷 家系中Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ各代均有FSCS 發(fā)病者，無性別差異，符合常染色體顯性遺傳特征。先證者家系中有2 例病理診斷為FSGS，1 例為局灶硬化伴系膜增殖，1 例為ESRD，符合家族性/遺傳性FSGS 的Duke 診斷標(biāo)準(zhǔn)［19］。3例發(fā)病者肌電圖檢查均正常排除腓骨肌萎縮癥。因此，先證者連續(xù)3 次尿蛋白+，結(jié)合明確的FSCS 家系，診斷為AD-FSGS［20］。

1.4 WT1、ACTN4、TRPC6 和INF2 基因檢測 考慮到既往研究對尿液篩查正常者進(jìn)行基因檢測的突變率極低，本研究選取尿常規(guī)和尿微量蛋白檢測異常的2 個家庭進(jìn)行基因檢測，其中Ⅱ7 和Ⅲ7 拒絕進(jìn)行基因檢測。采用QIAGEN 公司的血液基因組DNA 抽提試劑盒提取7 名家系成員基因組DNA。PCR 擴(kuò)增WT1 基因外顯子8、9，以及ACTN4、TRPC6 和INF2 基因所有外顯子，擴(kuò)增引物序列參考已報(bào)道的文獻(xiàn)［13～16，18，21］。PCR 反 應(yīng)條 件: 95℃預(yù) 變 性3min，94℃30s，55 ～60℃35 s，72℃40 ～50 s；35 個循環(huán)，72℃再延伸5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定擴(kuò)增條帶是否為目的條帶，若為目的條帶則進(jìn)行測序。使用ABI 3730 測序列分析儀( 美國ABI 公司) 進(jìn)行測序，使用Chromas 軟件讀取序列，測序結(jié)果與GenBank 中參考序列進(jìn)行比對，查找突變位點(diǎn)。在7 名家系成員中WT1、ACTN4和TRPC6 基因外顯子測序均未發(fā)現(xiàn)致病性突變位點(diǎn)，其中5 例發(fā)病者( Ⅱ6、Ⅱ8、Ⅲ8、Ⅲ10 和Ⅳ6) INF2 基因外顯子8均發(fā)現(xiàn)有缺失突變，缺失的堿基為CCCCACCCCCAC，缺失在外顯子8 第274 ～285 位點(diǎn)( 圖2A) ，未發(fā)現(xiàn)INF2 基因其他外顯子有致病性突變。另外2 名家系成員( Ⅱ9 和Ⅲ9)在5 例發(fā)病者INF2 基因缺失突變區(qū)未發(fā)現(xiàn)有相似突變( 圖2B) ，其他外顯子也未發(fā)現(xiàn)致病性突變。

圖2 INF2 基因突變圖Fig 2 Mutation of INF2 gene

1.5 生物信息學(xué)分析 利用美國在線NCBI ( The National Center for Biotechnology Information，http: //www. ncbi. nlm.nih.gov/pubmed) 初步分析突變對編碼蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響。INF2 表達(dá)分子inverted formin，人源性和鼠源性inverted formin 有高度同源性(80.8%氨基酸相同) 。鼠源性inverted formin 有4 個重要的結(jié)構(gòu)域( 圖3) ，即2 個formin 同源結(jié)構(gòu)域( FHl 和FH2) 、1 個Diaphanous 自調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域( Diaphanous-autoregulatory domain，DAD) 和1 個Diaphanous 抑制結(jié)構(gòu)域( Diaphanous-inhibitory domain，DID) 。DID 由INF2 基因外顯子2 至8 編碼，外顯子8 上的缺失 CCCCACCCCCAC ( c. 1249delCCCCACCCCCAC，p.T420_P423del) 位于DID( 圖3) ，導(dǎo)致DID 結(jié)構(gòu)域構(gòu)象改變影響inverted formin 功能。

圖3 INF2 蛋白結(jié)構(gòu)圖及本家系患者缺失突變部位Fig 3 Schematic representation showing exons 2 -8 of the INF2 gene and INF2 protein domain structure

2 討論

家族性FSGS 多數(shù)為遺傳性的，由相關(guān)致病基因突變引起，占FSGS 總數(shù)的18%［1，19］。AR-FSGS 患者臨床特征為發(fā)病年齡早，一般在嬰兒期或兒童早期發(fā)病，腎功能進(jìn)展快速，通常3 ～8 年進(jìn)展為ESRD，多數(shù)表現(xiàn)為腎病綜合征［5，10，22，23］。AD-FSGS 患者臨床特征為發(fā)病年齡晚，一般在青少年或成年期發(fā)病，腎功能進(jìn)展緩慢，可以表現(xiàn)為蛋白尿或腎病綜合征，也可伴有血尿和高血壓［13，15］。AD-FSGS和AR-FSGS 患者絕大多數(shù)對糖皮質(zhì)激素耐藥，對免疫抑制劑不敏感，少數(shù)對神經(jīng)鈣調(diào)蛋白抑制劑部分有效［5，13，15，22，23］。ACEI/ARB 治療能減輕蛋白尿和延緩腎功能進(jìn)展［3］。

本家系圖譜分析顯示，每代均有患者分布，無性別差異，符合常染色體顯性遺傳特征?；颊咂骄l(fā)病年齡26.9歲，5 例發(fā)病者均以尿檢異常( 蛋白尿) 就診，不伴有水腫，糖皮質(zhì)激素治療的2 例患者表現(xiàn)耐藥，除1 例發(fā)病10 年后進(jìn)展為ESRD，其他暫未進(jìn)展為ESRD。3 例腎活檢患者中，2 例表現(xiàn)為FSGS。本家系患者臨床特點(diǎn)與AD-FSGS 患者臨床特征相似，符合AD-FSGS 診斷。但本家系是以Ⅳ6 尿液篩查異常為線索，然后追問家族史得以發(fā)現(xiàn)，并通過肌電圖檢測排除腓骨肌萎縮癥，最終將Ⅳ6 及其他患者診斷為AD-FSGS。AD-FSGS 發(fā)病年齡可以在青少年或成年，存在差異，盡管本家系發(fā)病者存在Ⅱ～Ⅳ代發(fā)病年齡逐漸年輕的變化( 表1) ，可能與Ⅱ、Ⅲ代發(fā)病者出現(xiàn)臨床癥狀較重時才就診，使發(fā)現(xiàn)蛋白尿年齡較遲。本家系的發(fā)現(xiàn)警示臨床醫(yī)生對單純性蛋白尿患者應(yīng)該追蹤其家族其他成員的患病情況。盡管目前通過尿液篩查僅發(fā)現(xiàn)家族4 例成員有癥狀，但不能排除有血緣關(guān)系其他成員無病，應(yīng)該定期隨訪，定期性尿液篩查，以便早發(fā)現(xiàn)、早干預(yù)。

本研究通過對WT1、ACTN4、TRPC6 和INF2 基因直接測序發(fā)現(xiàn)，該AD-FSGS 家族5 例發(fā)病者均存在INF2 基因缺失突變，而且位于外顯子8 上。本家系發(fā)病者未發(fā)現(xiàn)WT1、ACTN4 和TRPC6 基因有致病性突變，可以排除WT1、ACTN4 和TRPC6 基因致病可能。INF2 基因突變可累及外周神經(jīng)和( 或) 腎臟，引起腓骨肌萎縮癥和( 或) FSGS［24］。近年來研究顯示，約15%的AD-FSGS 由INF2 基因突變引起［25，26］。早期研究發(fā)現(xiàn)INF2 基因突變都位于外顯子2 ～4上，主要突變?yōu)殄e義突變，因此對外顯子2 ～4 測序可作為INF2 基因突變的篩查方法［27］。但隨著研究的深入，在INF2 基因外顯子2 ～4 以外也有突變的報(bào)道［27］( 圖3) 。本研究通過直接測序發(fā)現(xiàn)，該AD-FSGS 家族5 例發(fā)病者均存在INF2 基因缺失突變，而且位于外顯子8 上。故c.1249delCCCCACCCCCAC( p. T420_P423del) 與既往關(guān)于INF2 基因研究的報(bào)道不同。該突變位于INF2 編碼分子inverted formin 重要的結(jié)構(gòu)域DID［27］( 圖3) 。該突變可能會引起DID 結(jié)構(gòu)域的改變，影響到inverted formin 對足細(xì)胞肌動蛋白調(diào)控作用，是足細(xì)胞損傷的原因，也是導(dǎo)致本家族AD-FSGS 患者發(fā)病的原因。

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