細(xì)胞原位培養(yǎng)載玻片法在產(chǎn)前診斷中的初步應(yīng)用

吳小青 李英 謝曉蕊 安剛 王燕 徐兩蒲 林娜 何德欽 林元

（福建省婦幼保健院 產(chǎn)前診斷中心，福建 福州 350001）

隨著產(chǎn)前篩查工作的普遍開展以及優(yōu)生優(yōu)育觀 念的不斷深入人心，產(chǎn)前診斷技術(shù)已經(jīng)成為臨床醫(yī)學(xué)科學(xué)的重要組成部分，其中羊水以及絨毛細(xì)胞培養(yǎng)與染色體制備技術(shù)是產(chǎn)前診斷中極為重要的技術(shù)之一。自1966年首例羊水細(xì)胞培養(yǎng)成功至今［1］，該技術(shù)已經(jīng)非常成熟。國(guó)內(nèi)目前普遍應(yīng)用的是培養(yǎng)瓶-胰酶消化培養(yǎng)法，該法存在耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣、細(xì)胞丟失大、無(wú)法區(qū)別真假嵌合等缺點(diǎn)。原位培養(yǎng)法則不存在以上缺點(diǎn)，能夠鑒別真假嵌合，但技術(shù)要求較高，在國(guó)內(nèi)一直無(wú)法得以推廣。本實(shí)驗(yàn)室在國(guó)內(nèi)原位培養(yǎng)法研究的基礎(chǔ)上，借鑒國(guó)外的成功經(jīng)驗(yàn)，采用原位培養(yǎng)載玻片法對(duì)早期絨毛、中期羊水進(jìn)行培養(yǎng)處理，并結(jié)合染色體全自動(dòng)掃描系統(tǒng)，自動(dòng)按照克隆進(jìn)行染色體掃描以供分析，大大提高了工作效率，現(xiàn)報(bào)告如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年6～12月在本院行介入性產(chǎn)前診斷標(biāo)本以及流產(chǎn)絨毛標(biāo)本共130例，其中羊膜腔穿刺100例，孕周18～24周；絨毛標(biāo)本30例，孕周11～14周，其中絨毛膜穿刺10例，流產(chǎn)絨毛20例。穿刺指征包括高齡、血清學(xué)篩查指標(biāo)異常、胎兒超聲指標(biāo)異常、異常生育史等。

1.2 主要試劑與儀器 羊水培養(yǎng)基、原位載玻片培養(yǎng)盒為杭州寶榮科技有限公司生產(chǎn)，培養(yǎng)瓶為丹麥Nunclon EasYFlask易用培養(yǎng)瓶。CO2培養(yǎng)箱為美國(guó)Thermo 3111型培養(yǎng)箱。倒置顯微鏡為Nikon TE2000-S。染色體分析儀為美國(guó)Genetix公司的GSL-120自動(dòng)染色體掃描儀。

1.3 標(biāo)本處理

1.3.1 羊水標(biāo)本 無(wú)菌條件下抽取羊水30 ml，分別注入3個(gè)無(wú)菌離心管中，1500 rpm離心10 min，棄上清，每管留取0.3 ml制成細(xì)胞懸液。其中一管按常規(guī)培養(yǎng)瓶法接種培養(yǎng)。另2管各加入1 ml培養(yǎng)基，充分混勻后分別涂抹于4個(gè)原位培養(yǎng)盒的載玻片上，接種后置于5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24小時(shí)后各補(bǔ)充4 ml培養(yǎng)基，接種后5天觀察。

1.3.2 絨毛標(biāo)本 將絨毛組織在生理鹽水中洗滌，用無(wú)菌手術(shù)刀片切碎，取小米粒大小按常規(guī)培養(yǎng)瓶法培養(yǎng)。另取米粒大小加入培養(yǎng)基1 ml制成懸液，分別涂抹于2個(gè)原位培養(yǎng)盒的載玻片上，置于5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后各補(bǔ)充4 ml培養(yǎng)基，接種后5天觀察。

1.4 觀察、換液、收獲

1.4.1 原位培養(yǎng)載玻片法 第5天開始觀察，當(dāng)羊水玻片上出現(xiàn)6～7個(gè)密度適中的克隆，絨毛標(biāo)本玻片上大約7～8個(gè)組織塊周圍細(xì)胞生長(zhǎng)，并有較多處于分裂期的圓形透亮細(xì)胞時(shí)便可收獲。收獲前一天換液，平均6～8天完成收獲。收獲過(guò)程：加40μl秋水仙素（100μg／ml）作用2小時(shí)，棄培養(yǎng)液，加37℃預(yù)溫的低滲液（1∶1，0.4%氯化鉀：0.4%檸檬酸三鈉）4 ml，低滲5分鐘，加1 ml固定液（3∶1甲醇∶冰醋酸）預(yù)固定10分鐘，棄低滲液，加4 ml固定液固定30分鐘，重復(fù)固定1次。取出玻片，置于37℃溫箱過(guò)夜，第二天80℃烤片2小時(shí)。

1.4.2 培養(yǎng)瓶法 第7天開始觀察，當(dāng)出現(xiàn)10個(gè)左右大、中克隆，并且有大量處于分裂期的圓形透亮細(xì)胞時(shí)開始收獲，平均8～10天完成收獲。收獲過(guò)程按照常規(guī)胰酶消化法進(jìn)行［2］。

1.5 核型分析 常規(guī)胰酶法G顯帶后的玻片置于GSL-120染色體全自動(dòng)掃描系統(tǒng)進(jìn)行克隆識(shí)別以及染色體掃描。先分析原位培養(yǎng)載玻片法的結(jié)果，培養(yǎng)失敗或者分析不夠時(shí)再結(jié)合分析培養(yǎng)瓶法的結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 原位培養(yǎng)載玻片法的100例羊水標(biāo)本中，成功100例，其中異常4例，核型分別為2例46，XX，inv（9），1例47，XX，＋21，1例45，XY，rob（13；14）（q10；q10）；30例絨毛標(biāo)本中，10例介入性產(chǎn)前診斷標(biāo)本均培養(yǎng)成功，核型均正常；余20例流產(chǎn)絨毛中，成功17例，其中5例異常，核型分別為2例47，（XX／XY），＋16，1例47，XX，＋14，1例45，X，1例47，XX，＋3，未發(fā)現(xiàn)嵌合異常。

2.2 原位培養(yǎng)載玻片法周期較培養(yǎng)瓶法短，平均6～8天，培養(yǎng)瓶法平均8～10天。

2.3 每張載玻片上含有可供分析核型的克隆數(shù)約6～10個(gè)（如圖1），核型完整，分散良好（如圖2），顯帶清晰（如圖3），完全滿足臨床分析要求。

3 討 論

細(xì)胞培養(yǎng)是產(chǎn)前診斷技術(shù)中極為重要的技術(shù)之一。傳統(tǒng)的羊水及絨毛培養(yǎng)為培養(yǎng)瓶法，收獲過(guò)程采用胰酶消化法。由于在剝離細(xì)胞以及多次離心過(guò)程中不可避免造成細(xì)胞的損傷和丟失，最終造成分裂相的減少、核型不完整；此外，2次的胰酶消化對(duì)染色體顯帶的清晰度會(huì)有一定的影響。原位培養(yǎng)法較之傳統(tǒng)方法省去了細(xì)胞轉(zhuǎn)移、離心等步驟，大大減少了細(xì)胞的丟失及損傷，最終得到可供分析的核型較多。但國(guó)內(nèi)部分實(shí)驗(yàn)室研究過(guò)程中曾用過(guò)培養(yǎng)瓶切割法、平皿蓋玻片法［3，4］，這2種方法的制片過(guò)程麻煩，保存不方便，更不能上機(jī)自動(dòng)掃描分析，所以均無(wú)法得以推廣應(yīng)用；也有部分實(shí)驗(yàn)室對(duì)玻片原位培養(yǎng)法［5］進(jìn)行研究，但是在染色體的分散以及顯帶環(huán)節(jié)上仍存在一定的問題，且未能做到自動(dòng)化核型掃描。本研究使用的原位培養(yǎng)盒中的載玻片是針對(duì)GSL-120染色體全自動(dòng)掃描平臺(tái)設(shè)計(jì)的，顯帶完成后，直接利用該平臺(tái)的克隆識(shí)別功能，對(duì)載玻片上每個(gè)克隆選擇拍攝3個(gè)良好的中期分裂相供我們?cè)陔娔X上進(jìn)行核型分析診斷，無(wú)需顯微鏡下分析，大大減少了工作量。

圖1 A為原位培養(yǎng)載玻片法培養(yǎng)盒，B為羊水原位培養(yǎng)克隆分布，C為絨毛原位培養(yǎng)克隆分布

圖2 原位培養(yǎng)載玻片法的細(xì)胞克?。?0倍視野）

圖3 原位培養(yǎng)載玻片法的染色體核型（100倍視野）

本研究利用原位培養(yǎng)載玻片法對(duì)100例羊水及30例絨毛進(jìn)行培養(yǎng)分析，除了3例絨毛培養(yǎng)失敗，其余均培養(yǎng)成功。培養(yǎng)失敗3例中有2例因接種過(guò)程污染導(dǎo)致，提醒我們?cè)跓o(wú)菌操作上應(yīng)提高警惕，其余1例絨毛在原位載玻片以及培養(yǎng)瓶中均無(wú)貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)，可能是因所取組織不新鮮導(dǎo)致。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中鑒于制片時(shí)環(huán)境溫度和相對(duì)濕度對(duì)染色體的分散過(guò)程影響較大［6］，通過(guò)摸索，我們將制備好的玻片置37℃溫箱過(guò)夜，得到了很好的分散效果以及良好的染色體形態(tài)。在羊水培養(yǎng)方面，本研究方法所需羊水量少，培養(yǎng)周期短，在克隆較小時(shí)收獲，保證6～8個(gè)含有3個(gè)以上良好分裂相的克隆便可。根據(jù)《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的胎兒染色體異常的細(xì)胞遺傳學(xué)產(chǎn)前診斷技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定，原位培養(yǎng)法分析時(shí)應(yīng)分別計(jì)數(shù)來(lái)自15個(gè)克隆的15個(gè)細(xì)胞，分析其中的5個(gè)核型，若不足15個(gè)克隆，則計(jì)數(shù)至少10個(gè)克隆，因此完全可以滿足臨床分析要求。

綜上所述，本研究?jī)?yōu)化了原位培養(yǎng)法的實(shí)驗(yàn)條件，結(jié)合染色體全自動(dòng)掃描平臺(tái)，建立了條件穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)單、分析自動(dòng)化的細(xì)胞原位培養(yǎng)載玻片法，在今后的產(chǎn)前診斷臨床工作中將有良好的應(yīng)用前景，值得推廣。

［1］Steele MW，Breg WR.Chromosome analysis of human amniotic-fluidcells［J］.Lancet，1966，1（6）：383-385.

［2］黃海龍，李英，徐兩蒲，等.1676例孕中期羊水細(xì)胞培養(yǎng)和染色體核型分析［J］.中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2009，26（6）：673-674.

［3］郝娜，許和，戚慶煒，等.平皿蓋玻片羊水細(xì)胞培養(yǎng)［J］.中華圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)雜志，2002，5（3）：215-217.

［4］吳菁，鐘梅，郭莉，等.兩種羊水原位培養(yǎng)方法在產(chǎn)前診斷應(yīng)用評(píng)價(jià)［J］.中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志，2012，20（7）：74-75.

［5］譚美玉，龔波，俞菁，等.玻片原位培養(yǎng)在產(chǎn)前診斷中的初步應(yīng)用［J］.中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志，2011，19（9）：50-52.

［6］Ann Tabor，Anne-Mare Lind，Alice Milbrat Andersen，et al.A culture vessel for amniotic fluid cells allowing faster preparation of chromosome slides［J］.Prenatal Diagnosis，2005，4（6）：451-455.