TUBB3/STMN1基因表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌EGFR通路的相關(guān)性

王波 王彬 張連斌 初向陽 余剛

肺癌是當(dāng)前世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）的發(fā)病率最高，占80%左右[1,2]。早期的NSCLC患者，治療原則以手術(shù)為主，術(shù)后根據(jù)分期等進(jìn)行輔助性化療。然而在諸多輔助化療方案中，僅有部分腫瘤患者從化療獲益。以鉑類聯(lián)合三代新藥（長春新堿，紫杉醇、吉西他濱、培美曲塞等）是治療NSCLC的基本方法，但有效率卻僅達(dá)25%-30%[3]?？赡芘c化療反應(yīng)率低或?qū)β?lián)合化療過程中產(chǎn)生的原發(fā)或繼發(fā)性藥物耐藥有關(guān)。而腫瘤細(xì)胞檢測相關(guān)基因表達(dá)水平的異常可能與肺癌產(chǎn)生耐藥的有密切關(guān)系。最常見的化療療效預(yù)測因子是鉑類藥物耐藥因子ERCC1和吉西他濱耐藥因子RRM1[4-6]?？刮⒐芤蜃覶UBB3和STMN1是長春新堿、紫杉類、多西他賽等化療藥物的主要耐藥因子，這些耐藥因子與化療藥物的關(guān)系已經(jīng)闡明[7,8]。近期研究發(fā)現(xiàn)這些耐藥因子受到腫瘤信號通路因子的調(diào)控，但還沒有明確結(jié)論。本研究主要探討抗微管類的靶點(diǎn)TUBB3和STMN1與表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）通路的關(guān)鍵因子的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 病例選擇 從53例NSCLC患者中篩選出完整臨床病理資料的46例NSCLC手術(shù)組織標(biāo)本（2012年5月-2013年5月）來自于中國人民解放軍總醫(yī)院胸外科，其中男性22例，女性24例，術(shù)后病理分期，T1期21例；T2期23例；T3期2例；T4期0例。

1.2 樣本采集及檢測方法

1.2.1 樣本處理 新鮮手術(shù)組織用10%中性福爾馬林固定16 h-24 h，酒精洗滌固定后，送至廣州益善醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所進(jìn)行檢測。

1.2.2 mRNA表達(dá)檢測技術(shù) 檢測方法為分支DNA-液相芯片法，同時(shí)定量檢測TUBB3、STMN1基因mRNA表達(dá)，分支DNA液相芯片技術(shù)是不進(jìn)行RNA抽提、純化和逆轉(zhuǎn)錄等步驟實(shí)現(xiàn)對mRNA表達(dá)水平的直接檢測的技術(shù)。在裂解樣本后，通過微球捕獲，采用探針的多位點(diǎn)特異配對、級聯(lián)放大的方式來實(shí)現(xiàn)信號的放大，讀數(shù)時(shí)采用液相芯片進(jìn)行結(jié)果的判讀，可以在一次反應(yīng)中同時(shí)檢測多種靶標(biāo)基因的mRNA表達(dá)水平，具體步驟包括：①取適量FFPE樣本加入裂解液，56oC下裂解反應(yīng)2 h；②預(yù)雜交：將樣本裂解液轉(zhuǎn)至孵育板上，加入支持探針-微球、支持延伸探針、緩沖液，55oC震蕩孵育過夜；③吸取上清：次日將孵育板放在磁力架上1 min，此時(shí)磁性微球聚集在底部，吸取棄去上清；④洗滌：加入洗滌液，震蕩洗滌1 min，孵育板放在磁力架上1 min，吸取棄去上清；重復(fù)3次；⑤雜交：加入擴(kuò)增延伸探針和標(biāo)記探針，50oC震蕩反應(yīng)1 h；⑥洗滌：孵育板放在磁力架上1 min，吸取棄去上清；用洗滌液洗2次；⑦信號放大：加入鏈霉親和素-藻紅蛋白，50oC震蕩反應(yīng)30 min；⑧洗滌：孵育板放在磁力架上1 min，吸取棄去上清；用洗滌液洗2次；⑨讀數(shù)：加入洗滌液，震蕩5 min，于Luminex閱讀儀上讀取數(shù)據(jù)；⑩分析：數(shù)據(jù)分析，得出檢測結(jié)果。

1.2.3 基因突變檢測技術(shù) 采用SurPle?x-xTAG70plex液相芯片技術(shù)對組織樣品進(jìn)行EGFR、KRAS、BRAF、PI3K基因突變檢測。該技術(shù)建立在Luminex平臺上，是一種集合流式細(xì)胞技術(shù)、激光技術(shù)、數(shù)字信號處理技術(shù)及傳統(tǒng)芯片技術(shù)為一體的新型生物檢測技術(shù)，液相芯片技術(shù)的技術(shù)步驟可分為微球編碼、探針偶聯(lián)、液相懸浮反應(yīng)和檢測分析。通過多重PCR方法獲得各基因外顯子上含有常見等位基因型的基因片段，進(jìn)行等位基因特異引物延伸（allele specific primer extension, ASPE）反應(yīng)，ASPE引物上的Tag（微球）序列與聚苯乙烯微球上的Anti-Tag序列特異結(jié)合，完成雜交反應(yīng)，雜交后的微球通過Luminex 200系統(tǒng)進(jìn)行分析，讀取每個(gè)樣品的中位熒光值（MFI）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Shapiro-Wilk（簡稱W檢驗(yàn)）、Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)（檢測KS檢驗(yàn)）與D檢驗(yàn)，進(jìn)行正態(tài)分布的考察。根據(jù)正態(tài)分布結(jié)果，選擇Pearson或Spearman相關(guān)性分析。以P=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者的臨床基線特征 46例NSCLC患者臨床特征描述見表1。

2.2 TUBB3及STMN1 mRNA表達(dá)水平檢測 采用分支-DNA液相芯片技術(shù)對TUBB3及STMN1進(jìn)行檢測，內(nèi)參基因?yàn)橐唤M基因（B2M, TBP, TFRC）。不同于Q-PCR，該技術(shù)無需RNA提取及PCR擴(kuò)增。46例NSCLC標(biāo)本中TUBB3的平均表達(dá)水平為0.185（0.07-0.721），STMN1的平均表達(dá)水平為1.328（0.70-4.80）。

表 1 患者基線臨床特征描述Tab 1 Characteristics of patients

2.3 EGFR通路關(guān)鍵基因突變檢測 采用xTAG技術(shù)進(jìn)行EGFR E18、E19、E20、E21，KRAS E2、E3，BRAF，PI3K E9、E20突變分析。結(jié)果如表2所示，46例標(biāo)本中，EGFR突變率50%（23/46），KRAS突變率13.1%（6/46）。PI3K突變率2.2%（1/46），沒有發(fā)現(xiàn)BRAF突變。

2.4 正態(tài)分布檢驗(yàn)及相關(guān)性分析 正態(tài)性是進(jìn)行Pearson關(guān)聯(lián)性分析的前提假設(shè)，若變量不滿足正態(tài)性，則不能采用Pearson相關(guān)進(jìn)行分析，只能采用Spearman相關(guān)進(jìn)行分析。因此在進(jìn)行相關(guān)性分析前應(yīng)對變量的正態(tài)性進(jìn)行檢驗(yàn)。本研究采用Shapiro-Wilk（簡稱W檢驗(yàn)）、Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)（檢測KS檢驗(yàn)）與D檢驗(yàn)考察TUBB3和STMN1的正態(tài)分布，如果P值大于0.10可認(rèn)為變量服從正態(tài)分布。本研究的STMN1和TUBB3的所有正態(tài)性檢驗(yàn)結(jié)果都不滿足P大于0.10這個(gè)條件，可認(rèn)為STMN1與TUBB3不服從正態(tài)分布，因此，本研究不能采用Pearson相關(guān)進(jìn)行分析，而采用Spearman相關(guān)進(jìn)行分析。

2.5 TUBB3/STMN1及EGFR通路臨床病理特征與臨床特征的相關(guān)性 結(jié)果顯示，TUBB3及STMN1的mRNA水平的表達(dá)與性別、年齡、分化程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等病理特征沒有明顯差異。EGFR E19突變與吸煙史相關(guān)（P=0.001,2），與其他病理特征沒有明顯差異（表3）。

2.6 TUBB3/STMN1與EGFR通路關(guān)鍵因子突變相關(guān)性分析 采用Spearman方法分析TUBB3/STMN1 mRNA表達(dá)之間的相互關(guān)系，結(jié)果顯示：TUBB3和STMN1存在很強(qiáng)的共表達(dá)性，TUBB3基因高表達(dá)時(shí)，STMN1趨向于高表達(dá)（P=0.006）。通過分析TUBB3/STMN1 mRNA與EGFR突變及KRAS突變的相互關(guān)系，結(jié)果顯示：EGFR E21突變與TUBB3存在負(fù)相關(guān)關(guān)系：EGFR E21無突變時(shí)TUBB3趨向于高表達(dá)（P=0.004,6）。KRAS E2突變與STMN1存在正相關(guān)關(guān)系：KRAS E2突變時(shí)STMN1趨向于高表達(dá)（P=0.038,6）（表4）。

表 2 基因突變分析Tab 2 Mutations of genes

表 3 基因表達(dá)及突變與臨床病理特征的相關(guān)性。Tab 3 Correlation between gene and pathology characteristics

表 4 基因相關(guān)性分析Tab 4 Correlations between genes

在多重檢驗(yàn)時(shí)需將檢驗(yàn)水準(zhǔn)進(jìn)行調(diào)整，結(jié)果才具有更高的重復(fù)性。本文中P值計(jì)算經(jīng)Bonferroni法調(diào)整后，檢驗(yàn)水準(zhǔn)設(shè)定為0.0004。

3 討論

隨著人類基因組學(xué)及功能基因組學(xué)研究的不斷深入，分子標(biāo)志物指導(dǎo)肺癌個(gè)體化治療已成趨勢。根據(jù)患者基因狀況等個(gè)體差異來制訂針對性的治療方案，可以避免不當(dāng)治療及無效治療，而確定個(gè)體差異則主要通過檢測分析患者特定基因的表達(dá)水平或突變來實(shí)現(xiàn)。

多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1（ERCC1）、核糖核苷酸還原酶M1（RRM1）、微管蛋白β-III（TUBB3）、Stathmin 1（STMN1）、胸苷酸合成酶（TYMS）、與NSCLC的化療療效直接相關(guān)[7-10]。本研究主要針對抗微管類的耐藥因子TUBB3及STMN1進(jìn)行。

細(xì)胞內(nèi)微管蛋白分α、β兩個(gè)亞型，是有絲分裂時(shí)紡錘體的基本組成單位，也是抗微管藥物的主要作用靶點(diǎn)。研究顯示，TUBB3編碼的Tubulin-III（β-3型微管蛋白）與抗微管化療藥敏感性的關(guān)系最密切。高TUBB3表達(dá)水平與長春瑞濱的耐藥性和生存期較短相關(guān)[11,12]。

STMN1基因同樣是抗微管類藥物的靶點(diǎn)，該基因編碼的STMN1蛋白通過促進(jìn)微管的解聚或阻止微管的聚合從而影響有絲分裂紡錘體的形成[12]。研究表明STMN1基因的mRNA表達(dá)水平與抗微管類化療的療效密切相關(guān)。其中一項(xiàng)NSCLC的臨床研究顯示，STMN1高表達(dá)患者紫杉類化療有效率低28.33%，而STMN1低表達(dá)患者化療有效率高60.00%（P=0.021）[13]。

腫瘤細(xì)胞EGFR信號通路上基因的突變狀態(tài)決定著EGFR靶向藥的療效，研究得出與其療效有關(guān)的突變位點(diǎn)主要有EGFR外顯子18、19和21的突變，KRAS外顯子2和3的突變，BRAF V600E點(diǎn)突變以及PI3K外顯子9和20的突變[14,15]。KRAS的突變在NSCLC患者中的發(fā)生率為10%-20%。既往研究證實(shí)KRAS的突變與性別、年齡、腫瘤分期以及臨床表現(xiàn)都沒有明顯聯(lián)系，但在不吸煙患者和病理類型為腺癌的患者中發(fā)生的幾率明顯升高。另有研究表明KRAS突變會影響EGFR-TKIs治療的療效，對存在KRAS基因突變的NSCLC患者應(yīng)用EGFR-TKIs治療的療效明顯降低，KRAS基因突變狀態(tài)可以作為NSCLC患者是否采用EGFR-TKIs治療的篩選標(biāo)準(zhǔn)[15,16]。

本研究主要分析EGFR突變、KRAS突變與TUBB3及STMN1的mRNA表達(dá)之間的關(guān)系，探索不同分子標(biāo)志物的相關(guān)性，嘗試揭示化療藥物的耐藥性機(jī)制。2008年的IPASS研究是肺癌個(gè)體化治療的里程碑，該研究除了發(fā)現(xiàn)EGFR突變與EGFR-TKI療效明確相關(guān)外，也發(fā)現(xiàn)了EGFR敏感突變的患者接受化療的效果要比EGFR野生型患者效果好[17]，提示了EGFR突變可能與化療的耐藥因子的相關(guān)性。隨后的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)：ERCC1基因與EGFR突變存在相關(guān)性，EGFR突變時(shí)，ERCC1趨向于低表達(dá)[18]。

本研究中分析了TUBB3和STMN1和EGFR信號通路的關(guān)系。檢測mRNA水平采用的方法是分支-DNA液相芯片，檢測過程中無需進(jìn)行RNA抽提、純化和逆轉(zhuǎn)錄等，一方面檢測結(jié)果基本不受樣品中RNA降解等因素的影響，保證了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性；另一方面，液相芯片以多個(gè)持家基因作對照（n≥3），準(zhǔn)確性高使檢測結(jié)果更為可靠。同時(shí)，本液相芯片使用的是探針的多位點(diǎn)特異配對、級聯(lián)放大的方式來實(shí)現(xiàn)信號的放大，與傳統(tǒng)的real time PCR（qPCR）方法相比，可同時(shí)檢測超過30個(gè)基因，大大減低操作過程或多步驟誤差積累對結(jié)果的影響。

本研究檢測基因突變的方法是xTAG液相芯片方法，該方法可同時(shí)檢測EGFR通路70個(gè)位點(diǎn)，真正做到多靶標(biāo)聯(lián)合檢測。與其他技術(shù)相比，該技術(shù)具有靈敏高、特異性強(qiáng)、量化可重復(fù)、操作簡便、結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)化等突出優(yōu)勢，實(shí)現(xiàn)了高度靈敏、重復(fù)性好的多指標(biāo)基因突變檢測在臨床腫瘤靶向治療的運(yùn)用。

在選擇可靠技術(shù)的前提下，我們對結(jié)果進(jìn)行了分析。通過分析基因與臨床病理特征的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，由于本研究中樣本量較少，沒有發(fā)現(xiàn)基因與臨床病理特征如性別、年齡、腫瘤大小等的明顯差異。由于隨訪數(shù)據(jù)還在進(jìn)行，本文無法分析TUBB3及STMN1與預(yù)后的相關(guān)性。

針對EGFR通路的研究中，本文發(fā)現(xiàn)EGFR敏感性突變（EGFR E18、E19、E21）的突變率達(dá)50%，KRAS突變率13.1%。文獻(xiàn)中報(bào)道的中國人群EGFR突變率一般30%-40%，這可能與本文的樣本量較少有關(guān)。在結(jié)果中發(fā)現(xiàn)不吸煙的患者中更容易出現(xiàn)EGFR E19的突變，這與之前的報(bào)道較為一致，而KRAS的突變和吸煙史沒有發(fā)現(xiàn)顯著性差異。

關(guān)于TUBB3/STMN1與EGFR突變的相關(guān)性的報(bào)道較少。Levallet等2012年報(bào)道顯示：KRAS突變導(dǎo)致TUBB3高表達(dá)（P＜0.001）的主要因素，通過基因敲除實(shí)驗(yàn)，證明了KRAS信號通路可能是調(diào)控TUBB3基因表達(dá)的關(guān)鍵因子[19]，提示了基因突變在化療藥物耐藥的機(jī)制的作用。

本研究的TUBB3和STMN1基因表達(dá)的相關(guān)性分析結(jié)果顯示：TUBB3和STMN1存在共表達(dá)。將TUBB3和STMN1共同與EGFR通路關(guān)鍵因子突變進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：EGFR E21無突變時(shí)TUBB3趨向于高表達(dá)（P=0.004,6），而STMN1表達(dá)與EGFR E21有相關(guān)性，但沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異（P=0.513,1）。KRAS E2突變與STMN1存在正相關(guān)關(guān)系，KRAS E2突變時(shí)STMN1趨向于高表達(dá)（P=0.038,6）。而TUBB3表達(dá)與KRAS突變有相關(guān)性，但沒有顯著性差異（P=0.26）。

這些結(jié)果顯示EGFR信號通路的關(guān)鍵因子EGFR、KRAS在調(diào)控TUBB3/STMN1基因表達(dá)方面可能起著關(guān)鍵作用。TUBB3/STMN1都是抗微管藥物的相關(guān)靶點(diǎn)，抗微管類藥物是作用于細(xì)胞微管，通過影響紡錘體的形成，從而抑制細(xì)胞有絲分裂。STMN1/TUBB3的表達(dá)水平與有絲分裂的活動相關(guān)，抑制這些基因的表達(dá)，可以干擾細(xì)胞的各種功能，從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡。本文研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KRAS的突變會導(dǎo)致STMN1的高表達(dá)，表明了EGFR通路中的基因活化狀態(tài)與細(xì)胞的增殖活動密切相關(guān)。Levallet報(bào)道中稱，TUBB3基因在支氣管細(xì)胞中的表達(dá)與PI3K/AKT/mTOR通路或KRAS/RAF/MEK等通路相關(guān)，這些通路上基因的活化狀態(tài)，是否影響著細(xì)胞的有些分裂，需要進(jìn)一步的RNAi試驗(yàn)及PI3K或MEK抑制劑來研究，確定下一步的機(jī)制，從而為化療耐藥機(jī)制提供重要基礎(chǔ)。

本研究沒有顯示出兩個(gè)指標(biāo)與EGFR突變或KRAS突變的一致相關(guān)性。這些可能是由于樣本數(shù)量少的原因，需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。也可能EGFR通路在調(diào)控兩個(gè)基因的表達(dá)時(shí)，存在差異性。這些都需要在進(jìn)一步的大樣本研究中驗(yàn)證。由于BRAF、PI3K基因在本文中突變較少，達(dá)不到統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，因此沒有進(jìn)行相關(guān)性分析，這些因子是否也調(diào)控著TUBB3/STMN1的表達(dá)，需要進(jìn)一步的研究來驗(yàn)證。

本研究初步分析了TUBB3/STMN1表達(dá)與EGFR信號通路的關(guān)鍵因子EGFR、KRAS突變的關(guān)系，初步結(jié)果驗(yàn)證了該信號通路在調(diào)控化療耐藥基因表達(dá)的作用。為個(gè)體化分子標(biāo)志物提供了很好的依據(jù)。提示了個(gè)體化分子標(biāo)志物臨床應(yīng)用過程中，聯(lián)合多個(gè)分子標(biāo)志物的分析，能提供更系統(tǒng)的參考依據(jù)，而接下來的工作需要進(jìn)一步研究調(diào)控的機(jī)制。