桔梗種子萌發(fā)對(duì)低溫、干旱及互作脅迫的響應(yīng)

劉自剛，沈 冰 ，張 雁

(1.西安理工大學(xué)西北水資源與環(huán)境生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安 710048;2.甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，蘭州 730070;3.商洛學(xué)院城鄉(xiāng)發(fā)展與管理工程系，商洛 726000)

桔梗(Platycodon grandiflorum(Jacq.)A.DC)屬于桔?？啤⒔酃?，是一種藥用、食用、觀賞兼用型多年生雙子葉草本植物［1］。桔梗主要分布在我國(guó)各省、俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)、朝鮮半島及日本列島等地［2］。近年來(lái)，桔?？顾ダ稀⒁职?、抗蟲(chóng)殺菌和氣味掩飾劑等功效相繼被發(fā)現(xiàn)，使社會(huì)對(duì)桔梗原材料的需求迅速增加。我國(guó)由于長(zhǎng)期的過(guò)量開(kāi)采利用導(dǎo)致野生桔梗生境出現(xiàn)片斷化破碎，其群體規(guī)模迅速萎縮，這不僅影響了生態(tài)系統(tǒng)的種類組成、數(shù)量結(jié)構(gòu)、生態(tài)過(guò)程以及非生物因素，同時(shí)也對(duì)物種群體遺傳結(jié)構(gòu)和生物多樣性程度產(chǎn)生了復(fù)雜的影響。嚴(yán)一字等對(duì)我國(guó)長(zhǎng)白山區(qū)野生桔梗資源調(diào)查結(jié)果表明，該地區(qū)桔梗野生資源正面臨瀕危滅絕的威脅［2］;據(jù)在陜南商洛境內(nèi)秦嶺山區(qū)12個(gè)點(diǎn)的調(diào)查結(jié)果顯示，僅3個(gè)點(diǎn)有野生桔梗零星分布，秦嶺野生桔梗種群已處于瀕危狀態(tài)中，桔梗野生資源保護(hù)和種群生態(tài)恢復(fù)已迫在眉睫。另外，在桔梗人工栽培中，常由于種子出苗率較低(僅1%左右)造成缺苗斷壟，難以構(gòu)建足夠的栽培群體而給藥材種植帶來(lái)嚴(yán)重?fù)p失。

在自然生境中桔梗主要以種子為材料繁殖后代種群［3］，桔梗成株對(duì)貧瘠等不良環(huán)境具有較強(qiáng)耐性，也是一種較耐干旱的中生植物，種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)階段是種群數(shù)量恢復(fù)和栽培群體構(gòu)建的關(guān)鍵時(shí)期［4］，但桔梗種子較為細(xì)小，千粒重平均約為1.0g［5］，其對(duì)水分、溫度等環(huán)境因子的變化較為敏感。桔梗土壤種子庫(kù)通常分布在2cm左右的土壤表層，由于春季多風(fēng)、溫度回升快、降雨也逐漸增多，很容易導(dǎo)致表層土壤種子處于干濕交替的環(huán)境之中，使種子萌發(fā)階段遭受干旱脅迫干擾，影響其種群更新過(guò)程和群體規(guī)模維系;人工栽培中水分限制也是產(chǎn)量形成的主要限制因素之一［6］。溫度在決定種子萌發(fā)中起雙重作用，即直接影響種子萌發(fā)或通過(guò)間接調(diào)節(jié)休眠影響種子萌發(fā)。在實(shí)驗(yàn)室條件下溫度對(duì)萌發(fā)作用效應(yīng)不僅具有在人工栽培生產(chǎn)中的指導(dǎo)性，同時(shí)也具重要的生態(tài)指示性［3］。因此，研究干旱、溫度及其雙重脅迫對(duì)桔梗種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響具有重要的生物學(xué)和生態(tài)學(xué)意義。

目前對(duì)桔梗種子的研究主要集中在種子成熟、休眠、貯藏方法等方面。劉自剛等對(duì)桔梗成熟過(guò)程中種子活力變化和生理動(dòng)態(tài)進(jìn)行了研究［6］;嚴(yán)一字等分析了桔梗種子質(zhì)量與出苗間關(guān)系［7］;趙敏等發(fā)現(xiàn)內(nèi)源抑制物質(zhì)是引起桔梗休眠的主要原因［8］;劉自剛對(duì)桔梗種子休眠破除方法進(jìn)行了研究，結(jié)果表明0.5%KNO3和250 mg/L GA3浸種24h可明顯促進(jìn)種子萌發(fā)［9］;郭巧生等篩選了桔梗種子發(fā)芽的最佳培養(yǎng)條件［10］。而關(guān)于干旱、溫度及其雙重脅迫對(duì)桔梗種子萌發(fā)和幼苗期的影響尚未見(jiàn)報(bào)道，因此，本研究探討了桔梗種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)對(duì)干旱、溫度及其雙重脅迫的響應(yīng)機(jī)制，旨在為桔梗野生種群的恢復(fù)及人工栽培群體的構(gòu)建提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試桔梗種子為2009年10月采自陜西香菊制藥有限公司商洛植物藥園2年生栽培群體，選取深黑色大小基本一致的飽滿種子為實(shí)驗(yàn)材料;供實(shí)驗(yàn)用的桔梗幼苗，由種子萌發(fā)培養(yǎng)得到。

1.2 方法

選取桔梗優(yōu)質(zhì)種子用0.4%的KMnO4溶液表面消毒，蒸餾水沖干凈，培養(yǎng)皿墊雙層濕潤(rùn)濾紙作為發(fā)芽床。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(對(duì)照發(fā)芽率為94.8%，10%PEG-6000處理的桔梗種子發(fā)芽率為53.6%，已接近抗旱半致死濃度;15%PEG-6000處理的發(fā)芽率為13.4%，已接近抗旱極限濃度)，模擬干旱脅迫設(shè)3個(gè)不同濃度為5%、10%、15%的聚乙二醇溶液(PEG-6000)，將供試種子分別放入加有等量上述3種PEG溶液和蒸餾水(對(duì)照)的發(fā)芽床中，每皿100粒，準(zhǔn)確稱重后，放入分別在培養(yǎng)箱10℃、15℃、20℃、25℃、10/20℃(據(jù)4月中旬當(dāng)?shù)仄骄罡?、最低溫設(shè)定)12h光/12h暗培養(yǎng)，變溫培養(yǎng)采用低溫12h(暗)，高溫12h(光)進(jìn)行處理，以后每日觀察統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)情況，并稱重法根據(jù)實(shí)際情況添加蒸餾水至原始重量，每處理重復(fù)3次。胚根與種子等長(zhǎng)為種子發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)芽結(jié)束后計(jì)算發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)，測(cè)定胚根和胚芽長(zhǎng)度，并稱幼苗鮮重、幼苗干重。相關(guān)指標(biāo)計(jì)算公式如下:(1)種子活力指標(biāo):種子發(fā)芽率(%)=n/N×100%;發(fā)芽指數(shù)(GJ)=∑Gt/Dt;活力指數(shù)(VI)=發(fā)芽指數(shù)(GJ)×S，式中，n為發(fā)芽終期全部正常發(fā)芽的種子數(shù)，N為供試種子總數(shù);Gt為t日發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的天數(shù)。S為平均胚根鮮重。(2)胚根和胚芽平均長(zhǎng)度:在種子萌發(fā)后10d，每一重復(fù)各取10株測(cè)定其胚根和胚芽長(zhǎng)度，并計(jì)算平均值。同時(shí)，稱幼苗鮮重、幼苗干重。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。不同萌發(fā)溫度和干旱脅迫條件下桔梗種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)等指標(biāo)采用雙因子方差分析(Two-way ANOVA)，不同處理間差異顯著性Duncan多重比較來(lái)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果分析

2.1 干旱、溫度對(duì)桔梗種子發(fā)芽起始時(shí)間的影響

圖1、表1所示，在適溫條件(20—25℃)下桔梗種子萌發(fā)起動(dòng)較快，低溫顯著延遲萌發(fā)起始時(shí)間。在25℃條件下培養(yǎng)6d，桔梗種子即可開(kāi)始萌發(fā)，但溫度降低到10℃時(shí)，培養(yǎng)18d以上種子才可萌發(fā)，其萌發(fā)起時(shí)間延遲了3倍以上。

在不同培養(yǎng)溫度條件下，干旱程度變化對(duì)桔梗種子萌發(fā)起始時(shí)間的影響效應(yīng)有所不同，即低溫條件(10—15℃)下培養(yǎng)，隨干旱脅迫程度增加種子萌發(fā)起始時(shí)間明顯延遲;而在適溫(20—25℃)下，干旱脅迫對(duì)起始時(shí)間無(wú)明顯影響。

2.2 干旱、溫度對(duì)桔梗種子萌發(fā)進(jìn)程的影響

不同溫度下培養(yǎng)的桔梗種子萌發(fā)進(jìn)程變化趨勢(shì)基本相同，即隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，種子萌發(fā)率均逐漸上升;在同一溫度條件下整個(gè)種子萌發(fā)過(guò)程中，隨干旱脅迫程度增加，種子萌發(fā)率基本呈降低趨勢(shì)(圖1)。

圖1 溫度對(duì)不同基因型桔梗種子萌發(fā)進(jìn)程的影響Fig.1 Effects of culture temperature and drought stress on seed germination course of Platycodon

2.3 干旱、溫度對(duì)桔梗種子萌發(fā)的影響

發(fā)芽率反映了種子在適宜條件下的萌發(fā)能力，發(fā)芽指數(shù)是種子活力水平的綜合體現(xiàn)［11-12］。在15—25℃及變溫條件下，隨著干旱脅迫程度的增加，桔梗種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)均呈逐漸下降趨勢(shì);而在10℃條件下，上述3項(xiàng)指標(biāo)卻均有先升后降的趨勢(shì)，即0—5%PEG范圍增加干旱脅迫程度，上述各種子萌發(fā)指標(biāo)均有所升高并達(dá)到最大值，之后干旱脅迫程度的再增加，種子的萌發(fā)逐漸被抑制。5%PEG處理的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)與對(duì)照(0%PEG)均在同一水平，表明輕度干旱脅迫對(duì)桔梗種子萌發(fā)無(wú)顯著影響(表1)。低溫(10℃)可顯著抑制桔梗種子的萌發(fā)，培養(yǎng)溫度的增加后，種子萌發(fā)各指標(biāo)均明顯升高。

在15—25℃溫度范圍內(nèi)及變溫10/20℃條件下對(duì)照種子均有較高的發(fā)芽率，不同溫度間雖略有變化，但未達(dá)顯著差異水平，種子均可正常萌發(fā)，綜合考慮發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)2項(xiàng)指標(biāo)，認(rèn)為桔梗種子萌發(fā)的最適溫度為20—25℃。方差分析結(jié)果顯示，溫度、干旱互作對(duì)桔梗種子萌發(fā)的具有顯著影響(表2)。

表1 低溫、干旱及其互作對(duì)桔梗種子萌發(fā)的影響Table1 Effects of culture temperature，drought stress and their interaction on seed germination of Platycodon

表2 溫度、干旱雙因素方差分析F值Table2 F values of temperature and drought stress with Two-way ANOVA

2.4 干旱、溫度對(duì)桔梗幼苗生長(zhǎng)的影響

表3顯示，在同一干旱脅迫條件下，桔梗幼苗根長(zhǎng)隨著培養(yǎng)溫度升高呈上升趨勢(shì)，且幼根的生長(zhǎng)呈“快-慢-快”的S型曲線型變化規(guī)律，即10℃根長(zhǎng)較短，生長(zhǎng)明顯被抑制，之后隨培養(yǎng)溫度升高根生長(zhǎng)迅速加快，15—20℃溫度范圍根長(zhǎng)增加較為平緩，之后生長(zhǎng)又顯著加快并達(dá)到最高值。低溫(10℃)也顯著抑制莖的生長(zhǎng)，培養(yǎng)溫度升高后莖生長(zhǎng)顯著加快，但在15—25℃范圍增加溫度，對(duì)莖生長(zhǎng)無(wú)顯著影響(除蒸餾水15℃培養(yǎng));變溫10/20℃培養(yǎng)的幼苗根長(zhǎng)、莖長(zhǎng)與20℃恒溫培養(yǎng)基本在同一水平，表明變溫的作用效應(yīng)基本取決于上限溫度?？傮w上看，10—20℃范圍內(nèi)的溫度變化對(duì)根/莖影響較小，25℃根/莖顯著升高，且根/莖的升高主要是由于根在此溫度下的快速伸長(zhǎng)引起的。25℃下幼苗鮮重和干重較其它溫度均明顯增大。

從表3中還可以看出，在同一溫度條件下，隨干旱脅迫程度的增加桔梗幼苗根長(zhǎng)和莖長(zhǎng)均呈下降趨勢(shì)，總體上看，但5%和10%PEG處理與對(duì)照變化不顯著，而15%PEG下根長(zhǎng)、莖長(zhǎng)均明顯縮短，表明重度干旱脅迫對(duì)桔梗幼苗生長(zhǎng)有明顯抑制作用，但輕度和中等脅迫對(duì)幼苗生長(zhǎng)影響甚微。重度干旱脅迫下(15%PEG)幼苗鮮重和干重與對(duì)照相比均明顯下降，輕度(5%PEG)、中度(10%PEG)脅迫下，10—25℃的恒溫條件下幼苗干重均比對(duì)照略有升高，而10/20℃變溫下幼苗干重略有下降，但干重的升降與對(duì)照間均無(wú)顯著差異(除25℃、5%PEG處理)。方差分析結(jié)果顯示，溫度、干旱互作對(duì)桔梗幼苗生長(zhǎng)各項(xiàng)指標(biāo)均有顯著影響，其中對(duì)幼苗干重的影響最為明顯(表2)。

表3 低溫、干旱及其互作對(duì)桔梗幼苗生長(zhǎng)的影響Table3 Effects of culture temperature，drought stress and their interaction on seeding growth of three variety of Platycodon

3 討論

溫度是影響種子萌發(fā)的重要因子之一［13-14］，對(duì)種子吸水、萌動(dòng)、胚根、胚芽伸長(zhǎng)至幼苗的形成整個(gè)過(guò)程均有重要作用［15-18］。溫度在決定種子萌發(fā)中可能起雙重作用，即直接影響種子萌發(fā)或通過(guò)間接調(diào)節(jié)種子休眠影響種子萌發(fā)［19］。溫度對(duì)桔梗種子萌發(fā)有顯著影響，郭巧生等研究表明桔梗種子在25—30℃下均有較高的發(fā)芽率［10］;15—25℃下不同基因型桔梗種子均可良好萌發(fā)，其發(fā)芽率在同一顯著水平;而30℃下發(fā)芽率均明顯下降，且下降幅度與種子基因型有關(guān)，與25℃下相比，赤峰桔梗、柞水野生桔梗種子發(fā)芽率下降31.6%以上，而商州桔梗僅下降10.2%。結(jié)果表明，低溫(10℃)條件下桔梗種子萌發(fā)被顯著抑制，之后隨溫度增加，種子萌發(fā)開(kāi)始明顯加快，在25℃和10/20℃變溫條件下發(fā)芽率達(dá)到最高。這種種子萌發(fā)機(jī)制確保了大部分種子在適合的季節(jié)萌發(fā)，因而增大了幼苗的存活機(jī)會(huì)。種子在萌發(fā)過(guò)程中進(jìn)行著活躍的代謝反應(yīng)［20-22］，在一定溫度范圍內(nèi)，隨溫度的升高種子萌發(fā)進(jìn)程加快，但過(guò)低的溫度會(huì)使膜的透性、膜結(jié)合蛋白及其他相關(guān)酶系活性降低［23-24］，從而造成種子萌發(fā)啟動(dòng)延遲和幼苗生長(zhǎng)延緩。桔梗種子細(xì)小，能供給種子萌發(fā)和胚根、胚芽伸長(zhǎng)的貯藏物質(zhì)數(shù)量十分有限，在種子萌發(fā)階段如遇低溫侵襲使出苗時(shí)間延長(zhǎng)，由于基礎(chǔ)生命代謝消耗可能造成貯藏物在幼苗出土前提早枯竭。種子萌發(fā)的適宜溫度與植物進(jìn)化的原生境有密切關(guān)系，在我國(guó)陜西秦嶺山區(qū)桔梗種子萌發(fā)出苗時(shí)間一般在4月中下旬，此時(shí)氣溫回升很快，白天很容易達(dá)到25℃左右，桔梗種子通過(guò)吸收土壤水分迅速啟動(dòng)萌發(fā)機(jī)制，快速動(dòng)員種子貯存物質(zhì)，通過(guò)轉(zhuǎn)化、運(yùn)輸和分配等代謝活動(dòng)完成種子萌發(fā)和幼苗形態(tài)構(gòu)建階段，使桔梗種子在較短的時(shí)間內(nèi)快速通過(guò)定植的這一關(guān)鍵期，從而大大降低了種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)這一環(huán)境敏感期可能遭遇極端氣候侵襲的幾率。

不同器官之間生物量分配與植物的干旱適應(yīng)能力密切相關(guān)［25-26］，在土壤水分缺乏時(shí)，植株地上與地下部分生物量的合理分配及生長(zhǎng)布局有利于增加植物水分利用率及干旱適應(yīng)能力［27-28］。一般地，在干旱脅迫下通過(guò)增大地下部分比例來(lái)增強(qiáng)植物對(duì)土壤深層水分的吸收能力，盡可能滿足旱生條件下植物對(duì)水分的生理生態(tài)需求以緩解水分缺乏對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的不利影響［29］。但是，干旱脅迫下植物的各器官生長(zhǎng)特征在不同物種之間存在較大的差異，如沙地柏(Sabina vulgaris)［30］實(shí)生苗幼根對(duì)土壤水分變化的敏感性高于幼莖，即隨干旱加深其地下部分生長(zhǎng)量所占比例明顯下降。而華薺苧(Moslach inensis)［31］根、莖生長(zhǎng)量比例與水分脅迫程度有關(guān)，中等干旱脅迫下(60%相對(duì)含水量)根生長(zhǎng)量比例最大，莖葉生長(zhǎng)量最小。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，輕度、中度干旱脅迫(5%—10%PEG)對(duì)桔梗幼苗根莖伸長(zhǎng)影響均較小。種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)階段是植物在特定生境定植建群的關(guān)鍵時(shí)期，為適應(yīng)可能遇到的逆境脅迫所采取種子萌發(fā)和幼苗形態(tài)建成策略是植物與其生境協(xié)同進(jìn)化的結(jié)果。在野生狀態(tài)下，桔梗種子萌發(fā)及幼苗形成時(shí)間一般在4—5月份，由于降水的年分布不均一造成我國(guó)多數(shù)北方地區(qū)春季容易遭遇干旱侵襲，在長(zhǎng)期這種季節(jié)性干旱脅迫壓力作用下，桔梗種子萌發(fā)和幼苗形態(tài)建成逐漸進(jìn)化出了較為完善的應(yīng)對(duì)機(jī)制，使大部分種子在遭遇一定強(qiáng)度干旱脅迫時(shí)仍能順利萌發(fā)，并完成幼苗形態(tài)建成，這一機(jī)制對(duì)桔梗種群更新過(guò)程及群體規(guī)模穩(wěn)定具有十分重要的生態(tài)意義。

另外，15%PEG使桔梗幼苗根莖的伸長(zhǎng)均被抑制，且根/莖比明顯降低，幼根所占比例顯著下降，而且較高的溫度還可加重這種趨勢(shì)。桔梗種子庫(kù)通常分布在2cm左右的土壤表層，由于春季多風(fēng)、溫度回升快、很容易導(dǎo)致表層土壤種子處于水分匱乏環(huán)境之中，使種子萌發(fā)階段遭受干旱脅迫干擾，而桔梗種子遇到較強(qiáng)干旱脅迫時(shí)即表現(xiàn)為發(fā)芽率降低，胚根生長(zhǎng)顯著被抑制而伸長(zhǎng)緩慢，幼根不能迅速深入深層土壤吸收水分，更加重了由于水分匱乏對(duì)機(jī)體造成的損傷，造成幼苗生長(zhǎng)困難，這就可以解釋春季如遇晴天干旱氣候桔梗幼苗大量枯死的原因。

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