泰樂(lè)菌素降解菌的篩選及其降解動(dòng)力學(xué)研究

孫瑞珠 ,馬玉龍 ,2*,張 娟 ,張作義 ,王 艷 ,王 敏 ,馬志強(qiáng) (.寧夏大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,寧夏 銀川75002；2.寧夏天然藥物工程技術(shù)研究中心,寧夏 銀川 75002；.銀川市西夏區(qū)農(nóng)牧水務(wù)局,寧夏 銀川 75002)

泰樂(lè)菌素(Tylosin)是一種由弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)獸用抗生素,被廣泛用于畜禽生產(chǎn)及治療[1].抗生素類(lèi)藥物進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后,約 30%～90%以藥物原形或代謝產(chǎn)物的形式隨畜禽糞便排出體外[2-4].近年來(lái),由于抗生素在畜牧養(yǎng)殖中的大量使用,導(dǎo)致其對(duì)環(huán)境污染的問(wèn)題日趨嚴(yán)重,如何解決此類(lèi)問(wèn)題,已成為當(dāng)前國(guó)際上的討論熱點(diǎn)之一[5].研究表明,土壤中抗生素殘留按濃度計(jì)算已經(jīng)達(dá)到 11～300μg/kg,這個(gè)數(shù)字已接近于土壤中其他農(nóng)藥類(lèi)有機(jī)污染物的含量水平[6-8].微生物發(fā)酵法生產(chǎn)抗生素過(guò)程中,發(fā)酵醪液進(jìn)行固液分離時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量廢棄藥渣,這些含有高營(yíng)養(yǎng)成分的藥渣若能有效利用,不僅可以緩解資源危機(jī),還可達(dá)到廢物治理的目的,然而,由于殘留有未分離完抗生素的存在,極大地限制了抗生素藥渣的循環(huán)利用.

近年來(lái),國(guó)內(nèi)外在廢水、畜禽糞便中殘留抗生素去除的研究報(bào)道較多,而關(guān)于藥渣中殘留抗生素處理的報(bào)道甚少. 姚斌等[9]研究表明,混合光合細(xì)菌PSB-DR對(duì)2,3,4-三氯苯酚的降解符合高濃度底物抑制的酶促反應(yīng)類(lèi)型.Kummerer等[10]、Ingerslev 等[11]和 Drillia 等[12]通過(guò)生物法,對(duì)生活廢水中殘留的環(huán)丙沙星、氧氟沙星、甲硝噠唑、復(fù)方新諾明、土霉素等進(jìn)行降解研究,但所得結(jié)果并不一致.甘露等[13]采用紫外輻射光解與生物降解同步耦合的氣升式內(nèi)循環(huán)反應(yīng)器降解喹啉,其降解動(dòng)力學(xué)結(jié)果可用有抑制性的Haldane模型描述.Yang等[14]報(bào)道,在厭氧條件下土壤中微生物對(duì)磺胺嘧啶類(lèi)抗生素所起的降解作用很小.而研究表明,堆肥能有效去除畜禽糞便中殘留的四環(huán)素類(lèi)抗生素[15-19].童子林等[20]提出豬糞在中溫(35℃)厭氧消化中,四環(huán)素和金霉素的降解過(guò)程符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程.

目前,抗生素類(lèi)污染物處理方法的研究主要集中于膜分離、好氧厭氧反應(yīng)器等工藝方面.生物修復(fù)是一種去除環(huán)境污染物經(jīng)濟(jì)有效的治理技術(shù)[21-23],而對(duì)降解抗生素類(lèi)污染物的高效降解菌株的篩選及其降解動(dòng)力學(xué)的研究報(bào)道較少.因此,本研究從降解動(dòng)力學(xué)角度,探討生物降解藥渣中殘留泰樂(lè)菌素的機(jī)理,以期為泰樂(lè)菌素廢棄藥渣環(huán)保處理提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試樣品 泰樂(lè)菌素標(biāo)樣購(gòu)于美國(guó)Sigma公司,泰樂(lè)菌素藥渣(泰樂(lè)菌素發(fā)酵醪液進(jìn)行固液分離時(shí)產(chǎn)生的菌餅部分,其主要成分是微生物菌絲體、未代謝利用完的有機(jī)物、無(wú)機(jī)鹽,其干物質(zhì)殘留的泰樂(lè)菌素含量為 2.14mg/g)由泰樂(lè)菌素生產(chǎn)企業(yè)提供.

1.1.2 培養(yǎng)基 酵母膏蛋白胨葡萄糖(YPD)培養(yǎng)基:酵母膏1g,蛋白胨2g,葡萄糖2g,水100mL(固體加入瓊脂 1.2g).藥渣培養(yǎng)基:泰樂(lè)菌素藥渣與水按 1:10比例(重量百分比)混合后,置室溫下浸泡 12～14h,離心棄沉淀,再通過(guò)抽濾棄除漂浮的雜質(zhì)即可.將泰樂(lè)菌素含量分別調(diào)為 50,100,200,300,400,500mg/L.藥渣蛋白胨培養(yǎng)基:在上述100mL藥渣培養(yǎng)基中加入蛋白胨0.5g.

1.1.3 菌株TS1分離源、篩選與馴化分離 菌株 TS1分離源采于長(zhǎng)期堆放泰樂(lè)菌素藥渣附近的土壤. 稱取10g土樣,加入裝有90mL pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液的250mL三角瓶中,并加入一定量的玻璃珠,在搖床上充分打散土樣后,取土壤浸出液備用.向土壤懸液中加入泰樂(lè)菌素藥渣及適量的蛋白胨、葡萄糖. 經(jīng)過(guò)逐次投加的方式,泰樂(lè)菌素濃度從 50mg/L依次增加到 500mg/L,置于35℃、130r/min的恒溫振蕩搖床中培養(yǎng)7d.每個(gè)馴化培養(yǎng)周期結(jié)束后,取培養(yǎng)液 10mL接入到90mL新鮮培養(yǎng)基中,開(kāi)始下個(gè)周期培養(yǎng),經(jīng)過(guò) 6個(gè)周期馴化培養(yǎng).將所篩選出的復(fù)合菌在含有泰樂(lè)菌素的平板上,根據(jù)菌落生長(zhǎng)快慢、大小、形狀、顏色等進(jìn)行多次劃線分離純化,得到 3株不同形態(tài)的單一菌株.用無(wú)菌接種環(huán)分別挑取分離的單一菌落1環(huán)于1.1.2所示的YPD液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),分別取10 mL處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液(約 48h 達(dá)到對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期,此時(shí)的菌體濃度為108cells/mL),接入到90mL泰樂(lè)菌素初始濃度為500mg/L的藥渣蛋白胨培養(yǎng)液中,考察 3種菌株對(duì)泰樂(lè)菌素的降解效果.通過(guò)降解效果的對(duì)比,篩選出降解能力較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)菌株.進(jìn)行純化后挑取單一菌落接種于斜面培養(yǎng)基,4℃冰箱保存.以上操作均在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 泰樂(lè)菌素降解試驗(yàn) 配制泰樂(lè)菌素濃度分別為50, 100, 200, 300, 400, 500mg/L的藥渣蛋白胨培養(yǎng)液,初始 pH 值調(diào)至 7.0～7.2,各取 90mL于250mL三角瓶中,分別接入10mL處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的菌液(所用培養(yǎng)基為1.1.2所示的YPD培養(yǎng)基);置于恒溫振蕩搖床中,在 35℃、130r/min下培養(yǎng),間隔12h定期取樣測(cè)定泰樂(lè)菌素濃度,研究不同初始濃度條件下泰樂(lè)菌素的降解效果.每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)平行.

1.2.2 共代謝基質(zhì)降解試驗(yàn) 配制泰樂(lè)菌素濃度為300mg/L的藥渣培養(yǎng)基,取90mL于250mL三角瓶中,分別加入葡萄糖、蛋白胨和氨氮各0.5g.再接入 10mL處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的菌液,置于35℃、130r/min恒溫振蕩搖床中培養(yǎng),間隔 12h定期取樣測(cè)定泰樂(lè)菌素濃度,探討菌株在加入蛋白胨、葡萄糖和氨氮作為共代謝基質(zhì)時(shí)對(duì)泰樂(lè)菌素的降解特性(同時(shí)以不外加其他基質(zhì)為對(duì)照),每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)平行.

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 微生物濃度測(cè)定方法 定期取2mL培養(yǎng)液,用UV-1200型紫外分光光度計(jì)測(cè)定500nm處的光密度(OD500),細(xì)菌濃度的計(jì)算公式為:Ccell=314.5× OD500[24].

1.3.2 泰樂(lè)菌素測(cè)定方法 降解前后藥渣中殘留泰樂(lè)菌素濃度采用高效液相色譜儀(LC-20AT,日本島津),用外標(biāo)法定量檢測(cè).樣品前處理為:取5mL樣品,用三氯乙酸終止反應(yīng)[25].然后用10mL乙腈超聲提取10min,5000r/min離心10min,共提取3次,收集上清液于45℃下減壓旋轉(zhuǎn)蒸干.再加入 10 mL醋酸鈉緩沖溶液(pH5.5)和 5mL正己烷,5000r/min離心10min,水相以1m/min流速,過(guò)預(yù)先用5mL甲醇、5mL水活化處理后的C18固相萃取柱,然后用5mL水和5mL甲醇-水(體積比為2: 8)洗滌C18柱.分析物用5 mL甲醇洗脫并收集全部洗脫液,用10 mL體積比為30:70的乙腈-磷酸鹽緩沖溶液溶解[26-27],待溶解完全后把溶液過(guò)0.45μm濾膜后保存,供高效液相色譜測(cè)定.

色譜條件:色譜柱為 Agilent HC-C18柱(5μm,250 mm×4.6mm);流動(dòng)相:乙腈:KH2PO4(0.02mol/L,pH2.5) = 30:70(體積比)等度洗脫;流速:1mL/min;柱溫:25 ℃;進(jìn)樣量:20μL;檢測(cè)波長(zhǎng):285nm.

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株TS1菌落形態(tài)

經(jīng)過(guò)平板初篩后獲得 3株菌,再經(jīng)過(guò)復(fù)篩后保留了 1株對(duì)泰樂(lè)菌素降解效果最大的菌,其對(duì)初始濃度為100mg/L的泰樂(lè)菌素在5d內(nèi)的降解率可達(dá)100%,將其命名為T(mén)S1.菌株TS1在YPD固體培養(yǎng)基上呈圓形,中間凸起,乳白色,表面光滑,不透明,邊緣整齊,菌落直徑約為2～3mm(圖1).菌株TS1經(jīng)革蘭氏染色確定為革蘭氏陰性菌,顯微鏡觀察是桿狀菌(圖2).

圖1 菌株TS1在YPD固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of strain TS1 on solid YPD medium

圖2 菌株TS1經(jīng)革蘭氏染色后細(xì)胞形態(tài)(×1000)Fig.2 Cell morphology of strain TS1 after Gram staining(×1000)

2.2 菌株TS1對(duì)不同初始濃度泰樂(lè)菌素的降解效果及降解動(dòng)力學(xué)

2.2.1 不同初始濃度泰樂(lè)菌素的降解效果 由圖 3可知,當(dāng)泰樂(lè)菌素初始濃度為 50,100mg/L時(shí),5d內(nèi)菌株TS1的降解率可達(dá)100%;當(dāng)泰樂(lè)菌素初始濃度為200mg/L時(shí),處理6d可降解99%;而當(dāng)泰樂(lè)菌素初始濃度為300～500mg/L時(shí),7d內(nèi)則可降解99%以上.圖4是初始濃度為300mg/L的泰樂(lè)菌素降解前后的液相色譜圖.雖然在所試泰樂(lè)菌素初始濃度范圍內(nèi),菌株TS1對(duì)泰樂(lè)菌素的降解率不同,但菌株對(duì)泰樂(lè)菌素的絕對(duì)降解量隨其初始濃度的增加而增大.同時(shí),降解效率和菌株生長(zhǎng)具有一定的一致性,開(kāi)始時(shí)(0～1d)菌株生長(zhǎng)處于延遲期,降解效率低;隨著菌株進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(2～3d),降解效率顯著增高;之后隨著時(shí)間的延長(zhǎng),由于營(yíng)養(yǎng)成分的缺失和代謝廢物的增加,菌株生長(zhǎng)逐漸到衰退期,對(duì)泰樂(lè)菌素的降解能力也隨之下降,降解曲線趨于平緩.

2.2.2 降解動(dòng)力學(xué)分析 將不同初始濃度下的降解數(shù)據(jù)按一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程進(jìn)行線性擬合,即:lnc=-kt+A,式中k[mg/(L·d)]表示降解速率常數(shù),t(d)是降解時(shí)間,c(mg/L)是降解t時(shí)殘留的泰樂(lè)菌素濃度,A為常數(shù).擬合結(jié)果顯示出良好的線性關(guān)系(圖5).

由表 1可見(jiàn),菌株對(duì)泰樂(lè)菌素的降解符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)特征,相關(guān)系數(shù)R2均高于0.95,所得一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程均能較好地反映菌株 TS1對(duì)泰樂(lè)菌素降解的趨勢(shì).泰樂(lè)菌素濃度在100～ 400mg/L時(shí),降解速率常數(shù)k均大于0.4,半衰期都小于2d;當(dāng)泰樂(lè)菌素濃度增加到500mg/L時(shí),降解速率常數(shù)k明顯下降,半衰期也延長(zhǎng)到2.03d.說(shuō)明高濃度的泰樂(lè)菌素對(duì)菌株的降解有抑制作用.

圖4 初始濃度為300mg/L的泰樂(lè)菌素藥渣經(jīng)菌株TS1處理前后的HPLC圖譜Fig.4 HPLC spectra of tylosin in pharmaceutical waste with initial concentration of 300 mg/L before (a) and after (b) treatment with strain TS1 for 7d

2.3 不同共代謝基質(zhì)中菌株對(duì)泰樂(lè)菌素的降解效果

由圖 6可見(jiàn),蛋白胨或氨氮分別做泰樂(lè)菌素降解的共代謝基質(zhì)時(shí),菌株在7d內(nèi)對(duì)初始濃度為300mg/L的泰樂(lè)菌素降解率可達(dá) 99%以上;而用葡萄糖作為共代謝基質(zhì)時(shí),菌株在 10d內(nèi)對(duì)其降解率只有 66.7%;而在不外加其他物質(zhì)的泰樂(lè)菌素藥渣體系中,9d內(nèi)泰樂(lè)菌素降解率可達(dá) 99%以上.由降解效率可知,蛋白胨的加入為菌株提供了優(yōu)質(zhì)氮源,前3d對(duì)泰樂(lè)菌素的降解率已達(dá)56.7%;氨氮體系中,菌株在第1d對(duì)泰樂(lè)菌素未顯降解作用,第2d才開(kāi)始降解,可能是菌株在適應(yīng)了環(huán)境后才開(kāi)始利用氨氮,但其降解速率仍然低于添加蛋白胨的體系;而體系中加入葡萄糖后,菌株對(duì)泰樂(lè)菌素的降解程度最小,在 10d內(nèi)的降解率低于菌株 TS1在泰樂(lè)菌素藥渣中的降解率,說(shuō)明葡萄糖的加入不利于菌株TS1對(duì)泰樂(lè)菌素的降解作用.

圖5 一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)線性擬合Fig.5 First-order kinetic relationship between ln c vs.time

表1 不同泰樂(lè)菌素初始濃度下降解動(dòng)力學(xué)結(jié)果Table 1 Degradation kinetic of tylosin at differently initial concentrations

由表 2可知,共代謝體系中菌株對(duì)泰樂(lè)菌素的降解反應(yīng)速率常數(shù)K蛋白胨+泰樂(lè)菌素藥渣＞K氨氮+泰樂(lè)菌素藥渣＞K葡萄糖+泰樂(lè)菌素藥渣,這與其降解率數(shù)據(jù)結(jié)果相一致.蛋白胨或氨氮的加入均有助于菌株對(duì)泰樂(lè)菌素的降解,其速率常數(shù)分別為 0.4174和 0.3719mg/(L·d),均大于泰樂(lè)菌素藥渣體系中的速率常數(shù)0.3301mg/(L·d),而加入葡萄糖后,反應(yīng)速率常數(shù)為0.1076mg/(L·d),t1/2延長(zhǎng)至 6.41d,提示葡萄糖的加入不利于菌株 TS1對(duì)泰樂(lè)菌素的降解作用.因?yàn)槠咸烟鞘俏⑸镙^容易利用的碳源,體系中加入葡萄糖時(shí),菌株優(yōu)先利用葡萄糖,導(dǎo)致菌株 TS1對(duì)泰樂(lè)菌素的降解速率下降,半衰期延長(zhǎng).因此,在菌株 TS1降解泰樂(lè)菌素的實(shí)際應(yīng)用中,可加入一定量氨氮,以促進(jìn)降解菌對(duì)泰樂(lè)菌素的降解作用.

圖6 不同降解體系中泰樂(lè)菌素濃度隨反應(yīng)時(shí)間的變化Fig.6 Changes of tylosin concentrations with time in various biodegradation systems

表2 不同降解體系中反應(yīng)動(dòng)力學(xué)Table 2 Kinetic in different biodegradation systems

3 結(jié)論

3.1 從長(zhǎng)期堆放泰樂(lè)菌素藥渣的土壤中篩選分離出1株泰樂(lè)菌素高效降解菌株 TS1.用該菌處理泰樂(lè)菌素藥渣,5d內(nèi)能完全降解初始濃度分為50和100mg/L的泰樂(lè)菌素;6d內(nèi)對(duì)200mg/L泰樂(lè)菌素的降解率達(dá) 99%以上,7d內(nèi)對(duì) 300～500mg/L泰樂(lè)菌素的降解率均達(dá)99%以上.

3.2 菌株TS1對(duì)不同初始濃度泰樂(lè)菌素的降解符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)特征.在所研究濃度范圍內(nèi),泰樂(lè)菌素濃度在100～400mg/L時(shí),降解速率常數(shù)k均大于0.4,半衰期小于2d;當(dāng)濃度達(dá)到一定限度時(shí),反應(yīng)速率開(kāi)始顯著下降,高濃度泰樂(lè)菌素抑制菌株對(duì)其的降解.

3.3 在降解體系中,蛋白胨或氨氮的加入促進(jìn)了菌株對(duì)泰樂(lè)菌素的降解作用,而葡萄糖則對(duì)菌株降解泰樂(lè)菌素有抑制作用.

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