胡桃楸土壤中莽草酸含量的測定

王東亮，袁 慧，楊立學(xué)*

（1.東北林業(yè)大學(xué)野生動物資源學(xué)院，哈爾濱 150040;2.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，哈爾濱 150040）

胡桃楸作為我國東北地區(qū)珍貴的“三大硬闊”樹種之一，是我國東北地區(qū)的主要用材樹種，具有重要的經(jīng)濟價值。造林實踐表明，胡桃楸純林長勢明顯劣于同齡胡桃楸－落葉松（Larix gemelini）混交林［1］。這其中除了混交林對土壤水分和養(yǎng)分合理、有效利用外［2－5］，胡桃楸純林的自毒作用是一個不可忽視的原因，很多研究表明胡桃楸是胡桃楸人工純林自毒現(xiàn)象的主要化感物質(zhì)［6－7］，但是仍然有很多胡桃楸根系分泌物的生態(tài)學(xué)作用有待于研究，莽草酸便是其中重要的一種［8］。

1 儀器與試藥

（1）儀器。Agilent1200型高效液相色譜儀、AE240電子天枰、冷凍干燥機FD－1A－50和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE－52。

（2）試藥。莽草酸對照品（上海晶純試劑有限公司HPIC測定，歸一化法計算其純度≥98%）。甲醇為色譜純（美國Dikma公司），其它試劑均為國產(chǎn)分析純。胡桃楸土壤樣品分別于2012年5月－9月采集于東北林業(yè)大學(xué)帽兒山尖砬溝森林培育試驗站。

2 色譜條件

流動相為甲醇和1%磷酸水溶液（15∶85），流速為1 mL/min，色譜柱為Agilent ZORBAX SBC18（4.6 mm ×150 mm，5 μm），檢測波長為213 nm，柱溫為25℃。在上述條件下，莽草酸與樣品中其他色譜峰基本達到基線分離，理論塔板數(shù)以莽草酸峰計算不低于5 000。莽草酸的保留時間約為2.16 min，如圖1所示。

3 分析方法與結(jié)果

3.1 溶液的制備

（1）對照品溶液的制備。精密稱取莽草酸對照品0.008 g，置于100 mL容量瓶中，加色譜級甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得對照品貯備液（每1 mL含莽草酸80 μg）。

（2）樣品溶液的制備。取凍干的土壤樣品10 g，置于250 mL蒸餾瓶中，量筒量取50 mL乙酸乙酯加入其中，水浴鍋90℃，冷凝回流8 h后，將蒸餾瓶移出水浴鍋，冷卻后將乙酸乙酯轉(zhuǎn)入另一蒸餾瓶，重復(fù)回流3次，將乙酸乙酯混合后，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40℃濃縮至干，殘余物用5 mL蒸餾水溶解，用2 mol HCl調(diào)節(jié)pH至2.0（以除去懸浮物雜質(zhì)的影響）。125 mL分液漏斗先加入約50 mL乙酸乙酯，將上述樣品溶液倒入分液漏斗，靜置分層后，將乙酸乙酯相分離出來，濃縮至干，用5mL甲醇溶液溶解，吸出經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后裝入樣品瓶，得胡桃楸樣品溶液。

圖1 莽草酸對照品HPLC圖譜Fig.1 The HPLC chromatogram of shikimic reference substance

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取莽草酸對照品貯備液1、2、4、6、8、10、12和14 mL，分別置于25 mL容量瓶中并定容，濃度分別為 3.2、6.4、12.8、19.2、25.6、32.0、38.4和44.8 μg/mL（峰面積分別為107.4、 216.3、 440.9、 676.2、 886.1、1 105.8、1 338.9 和 1 561.5），搖 勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾并分別裝入進樣瓶中備用。分別精密吸取10 uL注入色譜儀，得進樣量X（μg）與峰面積Y的線性方程。結(jié)果表明，莽草酸進樣量在3.2～44.8 μg/mL之間與峰面積成良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=34.788X－3.038 1，r=0.999 8（n=6）。

3.3 重復(fù)性試驗

精密吸取莽草酸對照品溶液（32.0 μg/mL）10 μL，重復(fù)進樣5次，測得色譜峰峰面積平均值為1 106.4，RSD為0.25%，顯示重復(fù)性良好，符合分析要求。

3.4 精密度試驗

精密稱取胡桃楸根際土樣品6份，按樣品測定法重復(fù)測定6次，測得莽草酸含量的平均值為10.806 μg/g，RSD為3.33%，顯示精密度良好，符合分析要求。結(jié)果見表1。

表1 胡桃楸根際土中莽草酸含量 （n=6）Tab.1 The content of shikimic acid in manchurian walnut rhizosphere soils

3.5 穩(wěn)定性試驗

取胡桃楸根際土樣品溶液，在色譜條件下，于0、4、8、12和24 h分別測定莽草酸峰面積，計算峰面積的RSD為1.45%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.6 準(zhǔn)確度實驗（加樣回收試驗）

精密稱取已知含量的胡桃楸根際土樣品約10g，共6份，分別精密加入一定量的莽草酸對照品，按樣品溶液制備及測定法操作，分別進行色譜分析，其平均回收率為97.85%，RSD為0.69%，符合分析要求。結(jié)果見表2。

3.7 樣品測定

精密吸取胡桃楸根際土和非根際土樣品溶液和莽草酸對照品溶液各10 μL，分別注入高效液相色譜儀，依法測定色譜峰峰面積，計算含量，結(jié)果見表3。

表2 回收率實驗結(jié)果Tab.2 The results of recovery experiments

表3 不同時期胡桃楸土壤中莽草酸的含量Tab.3 The content of shikimic acid in manchurian walnut soils in different periods

4 討論

（1）樣品溶液的制備方法的選擇。試驗中分別考察了超聲提取和加熱冷凝回流方法的提取效果，以加熱冷凝回流法提取效率最高。在加熱冷凝回流法中，又分別比較了不同的加熱時間（12 h和24 h）、不同的重復(fù)回流次數(shù)（4 h/次，6 h/次，8 h/次，12 h/次）、不同體積倍數(shù)甲醇（80%和100%）溶解效果，試驗結(jié)果表明，加熱24 h、重復(fù)回流3次（8 h/次），并最終用色譜級甲醇溶解，可將莽草酸從土壤中基本提取。

（2）流動相的選擇。實驗比較了甲醇－水、乙腈－水、乙腈－磷酸、甲醇－磷酸等流動相系統(tǒng)［9－13］，從分離情況和出峰時間等綜合分析選擇甲醇與1%磷酸水溶液等度洗脫為佳，并且保留值適宜，柱后處理簡單、方便。

（3）檢測波長的選擇。取一定量的莽草酸對照品，用流動相稀釋，放置于紫外可見分光光度計中，在190～400 nm范圍內(nèi)掃描［13］，結(jié)果顯示其最大吸收波長為215 nm，在相同色譜條件下對210、213、215、218和220 nm幾個波長處進行考察，結(jié)果表明，在213 nm處基線平穩(wěn)，并且峰形良好，故選擇213 nm作為檢測波長。

5 結(jié)束語

采用HPLC法測定胡桃楸土壤中的莽草酸的含量，經(jīng)預(yù)實驗優(yōu)化對比后認(rèn)為采用甲醇和1%磷酸（15∶85）體系檢測莽草酸，待測組分與其它組分有效分離，且保留值適宜，柱后處理簡便、省時。方法的線性范圍及分析結(jié)果的精密度、準(zhǔn)確度和回收率都能滿足胡桃楸土壤中的莽草酸定性和定量分析的要求。結(jié)果表明，胡桃楸土壤中根際土莽草酸含量大于非根際土中的含量，并且隨著時間的推移莽草酸的含量出現(xiàn)先增長，后降低的變化。

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