響應(yīng)面法優(yōu)化枇杷核多糖的提取工藝

吳竹青，黃 群，2，余 佶，2，喻林波

(1.吉首大學(xué)食品科學(xué)研究所，湖南吉首416000;2.吉首大學(xué)植物保護(hù)與利用湖南省高校重點實驗室，湖南吉首416000)

枇杷(Eriobotrya japonica(Thunbl)Lindl)為薔薇科植物，我國長江以南各省均有栽培，是我國特產(chǎn)水果，種植面積達(dá)11萬余公頃，年產(chǎn)量40余萬t，占世界枇杷鮮果總量的一半以上，按果核占果實重量的15%計算，每年將產(chǎn)生6萬t左右的枇杷核廢棄物。關(guān)于枇杷及其綜合利用研究主要涉及果汁、果酒等產(chǎn)品的研制，枇杷果實和果核的組成成分及營養(yǎng)價值分析［1-5］，枇杷果核中黃酮類、苦杏仁甙等的提?。?-7］，枇杷葉多糖的提取等［8-11］，但未見關(guān)于枇杷核多糖提取及應(yīng)用研究的相關(guān)報道。目前，可用于多糖提取的方法主要有水提、酶法提取、超聲波輔助提取、超聲-微波協(xié)同萃取等技術(shù)［8-13］。本實驗采用響應(yīng)面法研究不同酶解條件對枇杷核中多糖得率的影響，優(yōu)化枇杷核多糖提取工藝條件，為枇杷核資源的綜合利用提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枇杷核 產(chǎn)自湖南省湘西自治州吉首市，干燥至水分含量為7%左右，粉碎過40目篩，密封保存?zhèn)溆?纖維素酶2000U/g 南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司;蒽酮、濃硫酸、葡萄糖、95%乙醇等 國產(chǎn)分析純。

722型可見分光光度計 上海舜宇恒平科儀;PHS-25數(shù)字式pH計 上海日島科儀;CDE-220E多功能食品處理機(jī) 佛山市順德區(qū)歐科電器有限公司;KQ-250E型超聲波清洗器 昆山市超聲波儀器制造廠;HH.S型精密恒溫水浴鍋 江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠;GZX-9246MBE數(shù)顯熱鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實業(yè);LXJ-IIB離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 枇杷核多糖提取工藝流程 枇杷核→干燥→粉碎→過篩→稱量→料液混勻→超聲波處理→調(diào)節(jié)pH→酶解處理→離心分離→加95%的乙醇沉淀→離心→取沉淀→干燥→枇杷核多糖粗品

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與枇杷核多糖含量的測定精確稱取葡萄糖10mg，加蒸餾水100mL溶解，定容配制0.1mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后吸取標(biāo)液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL 于 10mL 帶塞比色管中，加蒸餾水至2mL，加入5mL蒽酮-硫酸溶液，搖勻放置10min，以加入葡萄糖溶液為0mL的比色管作為參比，在吸收波長490nm處測定其吸光度值［14］。以葡萄糖質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=2.06x-0.0003，相關(guān)系數(shù)R2=0.9998。

枇杷核多糖含量測定采取硫酸-蒽酮法，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算出枇杷核多糖含量［14］。

1.2.3 單因素實驗 分別考察料液比、超聲處理溫度、超聲處理時間、纖維素酶用量、酶解溫度、酶解時間、酶解pH對枇杷核多糖提取效果的影響。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化實驗 在上述單因素實驗基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計原理，選取纖維素酶用量、酶解溫度、酶解pH、酶解時間為主要考察因素，實驗因素水平見表1，以枇杷核多糖得率為響應(yīng)值，進(jìn)行中心組合實驗設(shè)計，得出相關(guān)實驗數(shù)據(jù)，采用SAS 8.1軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到枇杷核多糖提取的優(yōu)化工藝參數(shù)，并開展驗證性實驗［15-16］。

表1 Box-Behnken實驗設(shè)計因素水平表Table 1 Experimental variables and levels for the Box-Behnken experimental design

1.2.5 枇杷核多糖得率的計算 計算公式如下:

枇杷核多糖得率(%)=枇杷核多糖的質(zhì)量(g)/干燥枇杷核質(zhì)量(g)×100

2 結(jié)果與分析

2.1 枇杷核多糖提取單因素實驗

2.1.1 料液比對多糖得率的影響 在超聲處理溫度60℃、超聲處理時間30min、纖維素酶用量1.5%、酶解溫度50℃、酶解pH4.5和酶解時間2h的條件下，考察不同的料液比對枇杷核多糖提取效果的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 料液比對枇杷核多糖得率的影響Fig.1 Effect of material-water ratio on loquat core polysaccharide yield

由圖1可知，隨著液體比例增加，多糖得率開始上升，在料液比1∶15時達(dá)到最高，繼續(xù)增大液體比例多糖得率開始下降。當(dāng)液體含量較小時，體系黏稠度較大，經(jīng)超聲處理后體系內(nèi)乳化現(xiàn)象嚴(yán)重，酶與底物接觸不充分，導(dǎo)致酶解效果較差;隨著液體比例的增加，乳化現(xiàn)象減弱，酶解效果增強(qiáng)，而當(dāng)液體比例比較大時，底物濃度較低，反而影響了酶解效果，導(dǎo)致多糖得率下降，綜合考慮選擇料液比1∶15較適宜。

2.1.2 超聲處理溫度對多糖得率的影響 在料液比1∶15(g/mL)、超聲處理時間 30min、纖維素酶用量1.5%、酶解溫度50℃、酶解pH4.5、酶解時間2h的條件下，考察不同的超聲處理溫度對枇杷核多糖提取效果的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 超聲波處理溫度對枇杷核多糖得率的影響Fig.2 Effect of ultrasound treament temperature on loquat core polysaccharide yield

由圖2可知，超聲處理溫度為60℃時多糖得率最高。當(dāng)超聲處理溫度較低時，分子擴(kuò)散運動能力較小，物料的空化作用不夠完全，影響多糖得率;當(dāng)溫度高于60℃后，物料略有糊化而造成枇杷核多糖得率降低，故選超聲處理溫度為60℃為宜。

2.1.3 超聲處理時間對多糖得率的影響 在料液比1∶15(g/mL)、超聲處理溫度 60℃、纖維素酶用量1.5%、酶解溫度50℃、酶解pH4.5、酶解時間2h的條件下，考察不同的超聲處理時間對枇杷核多糖提取效果的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，隨著超聲處理時間的延長，枇杷多糖得率不斷提高，當(dāng)超聲處理時間超過30min以后，枇杷核多糖得率增加不明顯。這是由于超聲波作用在開始階段對細(xì)胞膜的破碎作用較大，溶出物多，得率不斷升高，當(dāng)溶解度達(dá)到飽和時，有效成分不再溶出，故選擇超聲處理時間為30min。

2.1.4 纖維素酶用量對多糖得率的影響 在料液比1∶15(g/mL)、超聲處理溫度 60℃、超聲處理時間30min、酶解溫度50℃、酶解 pH 4.5、酶解時間2h的條件下，考察不同的纖維素酶用量對枇杷核多糖提取效果的影響，結(jié)果見圖4。

在洛陽城里，從朝陽到夕陽，平時溫暖的風(fēng)，漸漸有了寒意，平時那些充滿活力的翠綠葉子，也變成了經(jīng)歷人間滄桑的枯黃葉子，以往繁華熱鬧的街道也變得冷清了，洛陽城里一切都變了。

圖3 超聲處理時間對枇杷核多糖得率的影響Fig.3 Effect of ultrasound treatment time on loquat core polysacchrride yield

圖4 纖維素酶用量對枇杷核多糖得率的影響Fig.4 Effect of amount of enzyme on loquat core polysaccharedes yield

由圖4可見，纖維素酶用量在0～1%時，多糖得率變化明顯，原因是纖維素酶能有效破壞其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使內(nèi)部的多糖釋放出來，繼續(xù)增加酶用量多糖得率增加緩慢。綜合考慮纖維素酶用量以1.5%為宜。

2.1.5 酶解溫度對多糖得率的影響 在料液比1∶15(g/mL)、超聲處理溫度60℃、超聲處理時間30min、纖維素酶用量1.5%、酶解pH4.5、酶解時間2h的條件下，考察不同的酶解溫度對枇杷核多糖提取效果的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 酶解溫度對枇杷核多糖得率的影響Fig.5 Effect of enzyme hydrolysis temperature on loquat core polysaccharides yield

從圖5可知，溫度升高，多糖得率逐漸增加，當(dāng)溫度高于50℃時，多糖產(chǎn)率開始下降。這是因為當(dāng)溫度升高時，分子熱運動加快，活化分子數(shù)增多，反應(yīng)速度加快，但超過最適溫度后，隨著溫度升高酶蛋白開始變性，酶活力降低，從而影響多糖得率。因此，酶解溫度以50℃為宜。

2.1.6 酶解時間對多糖得率的影響 在料液比1∶15(g/mL)、超聲處理溫度60℃、超聲處理時間30min、纖維素酶用量1.5%、酶解溫度50℃、酶解pH4.5的條件下，考察不同的酶解時間對枇杷核多糖提取效果的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 酶解時間對枇杷核多糖得率的影響Fig.6 Effect of enzyme hydrolysis time on loquat core polysaccharide yield

由圖6可知，隨著酶解時間的增加，枇杷核多糖得率逐漸增加。當(dāng)酶解時間超過1.5h后，多糖得率的增加趨于平緩。綜合考慮酶解時間取1.5h左右為宜。

2.1.7 酶解pH對多糖得率的影響 在料液比1∶15(g/mL)、超聲處理溫度60℃、超聲處理時間30min、纖維素酶用量1.5%、酶解溫度50℃、酶解時間2h的條件下，考察不同的酶解pH對枇杷核多糖提取效果的影響，結(jié)果見圖7。

圖7 酶解pH對枇杷核多糖得率的影響Fig.7 Effect of enzyme hydrolysis pH on loquat core polysaccharedes yield

如圖7可知，當(dāng)pH為4.5時，多糖得率最高，pH過高或過低均會影響多糖得率。因過高或過低的pH環(huán)境會導(dǎo)致酶蛋白的變性或失活，影響酶的活力;此外，pH還可通過影響底物分子的解離來影響反應(yīng)速度。故選擇酶解pH為4.5。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實驗

2.2.1 數(shù)學(xué)模型的建立與顯著性檢驗 根據(jù)Box-Benhnken中心組合實驗設(shè)計原理，在上述單因素實驗基礎(chǔ)上，選取纖維素酶用量(X1)、酶解pH(X2)、酶解溫度(X3)和酶解時間(X4)為考察因素，以枇杷核多糖得率(Y)為響應(yīng)值，進(jìn)行Box-Benhnken中心組合設(shè)計實驗，實驗設(shè)計方案及結(jié)果見表2。

采用SAS 8.1軟件對27個實驗點的枇杷核多糖得率進(jìn)行回歸分析，得出二次模型回歸統(tǒng)計分析表3。響應(yīng)值與各因素進(jìn)行回歸擬合后，得到枇杷核多糖提取得率的回歸方程為:

表2 Box-Behnken實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design arrangement and experimental results

表3 回歸統(tǒng)計分析表Table 3 ANOVA for the regression response surface model

從表3可知，模型極顯著，回歸決定系數(shù)R2=0.9873，修正決定系數(shù)=0.9746，回歸模型 p＜0.01，說明響應(yīng)值的變化有98.73%來源于所選因子變化，擬合程度良好，失擬項不顯著(p＞0.05)，回歸模型極顯著，模型能夠較好的描述枇杷核多糖提取實驗結(jié)果，說明本實驗所得二次回歸方程高度顯著，能很好地對響應(yīng)值進(jìn)行預(yù)測。從方差分析表中各因素F值可以看出，各因素對枇杷核多糖得率影響順序為:酶解pH＞酶解時間=纖維素酶用量＞酶解溫度，且影響均達(dá)到了顯著水平;二次項X12、X22、X32、對得率的影響極顯著，說明二次項響應(yīng)值影響極大且不是簡單的一次線性關(guān)系。去除不顯著項，回歸方程可簡化為:

2.2.2 響應(yīng)面圖形分析 根據(jù)簡化后回歸方程，采用SAS8.1軟件繪制出交互作用顯著兩因素的響應(yīng)面圖，見圖9所示，可以直觀地預(yù)測響應(yīng)值以及確定變量相互作用的關(guān)系。由圖9a～9d可知，纖維素酶用量與酶解pH、纖維素酶用量與酶解溫度、酶解pH與酶解溫度、酶解pH與酶解時間等兩兩因素交互作用對枇杷核多糖得率的效應(yīng)相關(guān)性呈山丘形或馬鞍形曲面，其中，酶解pH與酶解時間之間的交互作用達(dá)到了顯著水平，而纖維素酶用量與酶解pH、纖維素酶用量與酶解溫度、酶解pH與酶解溫度之間的交互作用達(dá)到了極顯著水平。

圖9 各兩因素交互作用對枇杷核多糖得率影響的響應(yīng)面Fig.9 Response surface plot showing the effect of every two factors interaction on the yield of loquat core polysaccharides

2.2.3 最優(yōu)條件的求解及驗證實驗 為求得各因素的最優(yōu)條件，對回歸方程進(jìn)行數(shù)學(xué)處理。由SAS8.1分析得到的最優(yōu)響應(yīng)值(Y)時，纖維素酶用量(X1)、pH(X2)、酶解溫度(X3)、酶解時間(X4)相對應(yīng)的編碼值分別為 0.64、0.29、-0.15、0.61，利用編碼公式將上述編碼值轉(zhuǎn)變?yōu)閷嶋H參數(shù)值，得出纖維素酶用量 1.819%、酶解 pH4.654、酶解溫度49.27℃、酶解時間1.815h，此時枇杷核多糖得率的模型理論預(yù)測值為10.05%?？紤]實際可操作性，選定優(yōu)化工藝條件參數(shù)為纖維素酶用量1.8%、酶解pH4.7、酶解溫度49℃、酶解時間1.8h。

在優(yōu)化后的工藝條件下進(jìn)行3次驗證實驗，枇杷核多糖得率平均值為9.96%，與模型理論預(yù)測值誤差在1%以內(nèi)，說明采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化得到的工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有較高應(yīng)用價值。

3 結(jié)論

通過單因素實驗對影響枇杷核多糖提取效果的料液比、超聲處理溫度、超聲處理時間、纖維素酶用量、酶解溫度、酶解pH、酶解時間進(jìn)行考察，然后采用響應(yīng)面分析法對主要影響因素進(jìn)行中心組合設(shè)計實驗并進(jìn)行響應(yīng)面分析，相關(guān)因素對枇杷核多糖提取得率影響的主次順序為酶解pH＞酶解時間=纖維素酶用量 ＞酶解溫度，得到回歸方程為:Y=由回歸統(tǒng)計分析結(jié)果可知，在本實驗范圍內(nèi)建立的二次線性回歸模型準(zhǔn)確有效，可用來預(yù)測設(shè)定條件范圍內(nèi)及其周圍的枇杷核多糖提取工藝參數(shù)。優(yōu)化工藝條件為料液比1∶15、超聲處理溫度60℃、超聲處理時間30min、酶用量1.8%、酶解溫度49℃、酶解 pH4.7、酶解時間1.8h，在此優(yōu)化工藝條件下，干燥處理后枇杷核多糖得率可達(dá)9.96%，與數(shù)學(xué)模型的理論預(yù)測值基本一致。

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