紗布纖維可否在小鼠氣囊植骨模型中誘發(fā)炎性骨溶解的研究

萬 睿，李 平，周園東，張 健

人工關(guān)節(jié)置換術(shù)過程中術(shù)者需使用大量醫(yī)用紗布拭干組織及骨周圍滲血，以保證手術(shù)視野的清晰，但紗布纖維存在不同程度地遺留。紗布纖維為醫(yī)學(xué)非移植材料［1］，遺留在體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生異物反應(yīng)，形成慢性肉芽腫［2］。無菌松動(dòng)是人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后最常見的中遠(yuǎn)期并發(fā)癥，那么松動(dòng)界膜中的炎癥反應(yīng)與紗布纖維遺留引起的異物反應(yīng)是否有相似的形成機(jī)制或共同的細(xì)胞因子參與，慢性肉芽腫中的巨噬細(xì)胞是否有分化為破骨細(xì)胞的潛能從而產(chǎn)生溶骨作用?本研究通過建立小鼠氣囊植骨模型［3］以檢驗(yàn)紗布纖維引起的囊壁組織及移植骨炎癥反應(yīng)的相關(guān)因子的水平［4］，觀察紗布纖維是否會(huì)誘發(fā)炎性骨溶解，為優(yōu)化手術(shù)操作奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 脛骨標(biāo)本 經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后，選擇2011年3—4月4例在我院行膝關(guān)節(jié)置換術(shù)患者丟棄的脛骨上端松質(zhì)骨作為脛骨標(biāo)本，將每例患者的脛骨標(biāo)本分為2塊，1塊采用干紗布擦拭 (干紗布組)，另1塊采用0.9%氯化鈉溶液浸濕的濕紗布擦拭 (濕紗布組)，擦拭壓力、方向及次數(shù)均相同，之后按照標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行處理。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 近交系SPF級(jí)BALB/c小鼠30只，雌雄各半，周齡8～10周，雌雄分開喂養(yǎng)。采用簡單隨機(jī)分組法將小鼠分為對(duì)照組、聚乙烯組和紗布組，每組10只。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，處置方法嚴(yán)格按照動(dòng)物倫理委員會(huì)要求。

1.1.3 主要試劑 (1)聚乙烯顆粒:超高分子聚乙烯購自美國強(qiáng)生DePuy公司并由美國BioEngeering Solutiongs公司制備成直徑為8 μm的顆粒，經(jīng)環(huán)氧乙烷消毒滅菌后配置成1%質(zhì)量濃度的0.9%氯化鈉溶液混懸液備用。(2)紗布纖維:醫(yī)用脫脂棉紗布?jí)K購自云南象山醫(yī)用材料有限公司，剪碎后經(jīng)超聲細(xì)胞破碎機(jī)粉碎，人工分揀、稱量、高溫蒸氣滅菌、干燥后備用。(3)抗酒石酸酸性磷酸酶 (TRAP)試劑盒購自南京建成科技有限公司;兔抗小鼠白介素 (IL) －1β單克隆抗體、兔抗小鼠IL－6單克隆抗體、兔抗小鼠腫瘤壞死因子α(TNF－α)單克隆抗體、SP－0023免疫組化試劑盒均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;二氨基聯(lián)苯胺 (DAB)試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;小鼠TNF－α酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒，購自美國R＆D公司;Trizol試劑購自美國Life Technologies公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒均購自上海 (東洋紡)生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 建立模型 (1)第1天，取小鼠背部正中線上1.5 cm處為進(jìn)針點(diǎn)，去毛、消毒，皮下注射空氣2.5 ml，第3天再次注射空氣1 ml，氣囊形成。(2)第9天，每組選取2只小鼠使用頸椎脫臼法處死，取顱骨并分離周圍組織 (不損傷骨表面)，將顱骨分割成4 mm×3 mm大小骨片，置入0.9%氯化鈉溶液中備用，作為該組其他小鼠植骨供體;每組其他小鼠采用3.5%水合氯醛進(jìn)行腹腔麻醉，然后在氣囊上切開一個(gè)5 mm長的切口，植入備好的顱骨骨片，使用0號(hào)絲線縫合切口，1∶100青鏈霉素溶液0.3 ml注射至氣囊預(yù)防感染。由于紗布纖維無法通過注射器注射入氣囊，因此，紗布組小鼠在顱骨骨片植入后即植入5 mg干重的紗布纖維。(3)第10天，聚乙烯組小鼠氣囊內(nèi)注入含聚乙烯顆粒5 mg的混懸液0.5 ml，對(duì)照組小鼠氣囊內(nèi)注入0.9氯化鈉溶液0.5 ml;以上步驟均嚴(yán)格按照無菌原則操作。(4)第17天，處死全部小鼠，取囊壁組織，石蠟包埋，液氮保存，骨片經(jīng)10%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣液脫鈣。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 電鏡觀察 干紗布組和濕紗布組各選取4個(gè)視野，采用日立S－3000N掃描電鏡進(jìn)行拍照，Image－Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行圖像分析，計(jì)算紗布纖維覆蓋率。

1.3.2 肉眼觀察 小鼠處死前活動(dòng)情況、死亡情況及處死后切口炎癥反應(yīng)情況。

1.3.3 蘇木素－伊紅 (HE)染色 采用HE染色法觀察囊壁組織單核細(xì)胞計(jì)數(shù)和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野，取平均值。參考文獻(xiàn) ［5］中的方法確定炎癥反應(yīng)程度，即陰性(－)、陽性 (+)、強(qiáng)陽性 (++)。

1.3.4 TRAP染色 骨片行石蠟切片，切片厚度為4 μm，按照試劑盒說明書進(jìn)行染色;以破骨細(xì)胞胞質(zhì)出現(xiàn)紫紅色顆粒為陽性，通過圖像分析軟件計(jì)算紫紅色胞質(zhì)所占視野面積百分比，每個(gè)標(biāo)本采集2個(gè)中倍鏡視野取平均值。

1.3.5 免疫組織化學(xué)染色 囊壁組織經(jīng)固定后行石蠟切片，切片厚度為4 μm，常規(guī)脫蠟水化，抗原修復(fù)采用微波爐法;以IL－1β、IL－6、TNF－α單克隆抗體分別進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，每個(gè)標(biāo)本采集2個(gè)中倍鏡視野取平均值。通過圖像分析軟件計(jì)算各因子蛋白表達(dá)水平，以平均光密度值表示。

1.3.6 ELISA 將液氮保存的囊壁組織于勻漿器中勻漿，取上清液檢測TNF－α水平。

1.3.7 實(shí)時(shí)定量PCR 由于經(jīng)費(fèi)限制，每組采用簡單隨機(jī)法選取3只小鼠進(jìn)行檢測。取100 mg囊壁組織加入Trizol試劑，于勻漿器中勻漿，常規(guī)提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按照試劑盒說明書檢測TNF－α mRNA表達(dá)水平。TNF－α上游引物為5'－CGGGCAGGTCTACTTTGGAG－3'，下游引物為5'－CAGGTCACTGTCCCAGCATC－3'，擴(kuò)增片段長度為230 bp;以β－actin為內(nèi)參照，上游引物為5'－CTGAGAGGGAAATCGTGCGT－3'，下游引物為5'－CCACAGGATTCCATACCCAAGA－3'，擴(kuò)增片段長度為208 bp，引物合成由美國Life Technologies公司完成。擴(kuò)增條件:預(yù)變性:95℃，1 min;循環(huán) (40次):95℃，15 s，58℃，20 s，72℃，20 s;末段延伸:72℃，5 min;溶解曲線:72～95℃，每20 s升溫1℃。結(jié)果處理采用ΔΔCT法，TNF－α mRNA 表達(dá)倍數(shù) =2－K，K=(CT樣本目的基因－CT樣本內(nèi)參基因) － (CT對(duì)照目的基因－ CT對(duì)照內(nèi)參基因)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以 (±s)表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn);多組間等級(jí)資料比較采用秩和檢驗(yàn)，兩兩比較采用Mann－Whitney U檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 電鏡觀察 干紗布組纖維覆蓋率為 (18.11±6.94)%，濕紗布組為 (4.86±3.64)%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=3.38，P ＜0.05，見圖1)。

2.2 肉眼觀察 各組小鼠處死前活動(dòng)情況良好，無死亡小鼠;處死后發(fā)現(xiàn)，聚乙烯組和紗布組小鼠切口存在不同程度的炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為紅斑及水腫，對(duì)照組小鼠無明顯炎癥反應(yīng)。

2.3 HE染色 各組小鼠囊壁組織炎癥反應(yīng)程度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05，見表1)。其中，紗布組和聚乙烯組小鼠單核細(xì)胞反映的炎癥反應(yīng)程度(U紗布組vs.對(duì)照組=6.00，U聚乙烯組vs.對(duì)照組=4.00)、 淋巴細(xì)胞反映的炎癥反 應(yīng) 程 度(U紗布組vs.對(duì)照組=3.50，U聚乙烯組vs.對(duì)照組=7.00) 與對(duì)照組小鼠比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);紗布組小鼠與聚乙烯組小鼠單核細(xì)胞反映的炎癥反應(yīng)程度 (U=28.00)、淋巴細(xì)胞反映的炎癥反應(yīng)程度 (U=28.00)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。

圖1 干紗布組和濕紗布組電鏡觀察結(jié)果 (×30)Figure 1 Result of SEM between dry sponge group and wet sponge group

表1 各組小鼠囊壁組織炎癥反應(yīng)程度比較 (只)Table 1 Comparison of inflammation reaction of air pouch wall tissue in each group

2.4 TRAP染色 各組小鼠TRAP染色陽性面積比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05，見圖2、表2)。其中，紗布組和聚乙烯組小鼠與對(duì)照組小鼠比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t紗布組vs.對(duì)照組=4.93，t聚乙烯組vs.對(duì)照組=5.41，P ＜ 0.05); 紗布組小鼠與聚乙烯組小鼠比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=0.48，P＞0.05)。

2.5 免疫組織化學(xué)染色 各組小鼠囊壁組織IL－1β、IL－6、TNF－α蛋白表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01，見圖3、表2)。其中，紗布組和聚乙烯組小鼠IL－1β蛋白表達(dá)水平 (t紗布組vs.對(duì)照組=6.42，t聚乙烯組vs.對(duì)照組=5.77)、IL －6 蛋白表達(dá)水平 (t紗布組vs.對(duì)照組=7.01，t聚乙烯組vs.對(duì)照組=5.90)、TNF － α蛋白表達(dá)水平 (t紗布組vs.對(duì)照組=15.26，t聚乙烯組vs.對(duì)照組=10.56) 與對(duì)照組小鼠比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);紗布組小鼠與聚乙烯組小鼠TNF－α蛋白表達(dá)水平比較，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=4.70，P＜0.05)，而IL－1β、IL－6蛋白表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t值分別為1.17和1.12，P＞0.05)。

2.6 ELISA 各組小鼠囊壁組織TNF－α水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01，見表2);各組兩兩比較 (t紗布組vs.對(duì)照組=35.10，t聚乙烯組vs.對(duì)照組=25.09，t聚乙烯組vs.紗布組=10.01)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。

2.7 實(shí)時(shí)定量PCR 對(duì)照組小鼠TNF－α mRNA表達(dá)倍數(shù)為(1.06±0.50)、聚乙烯組為 (3.29±0.16)、紗布組為 (4.15±0.18)，各組小鼠TNF－α mRNA表達(dá)倍數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F=375.31，P＜0.001);各組兩兩比較(t紗布組vs.對(duì)照組=26.54，t聚乙烯組vs.對(duì)照組=19.16，t聚乙烯組vs.紗布組=7.38)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。

表2 各組小鼠顱骨骨片TRAP染色陽性面積、囊壁組織各細(xì)胞因子平均光密度值及囊壁組織TNF－α水平比較 (±s)Table 2 Comparison of positive area of calvarial TRAP staining，AOD of each cytokine and TNF－α levels in air pouch wall tissue in each group

表2 各組小鼠顱骨骨片TRAP染色陽性面積、囊壁組織各細(xì)胞因子平均光密度值及囊壁組織TNF－α水平比較 (±s)Table 2 Comparison of positive area of calvarial TRAP staining，AOD of each cytokine and TNF－α levels in air pouch wall tissue in each group

注:TRAP=抗酒石酸酸性磷酸酶，IL－1β=白介素1β，IL－6=白介素6，TNF－α=腫瘤壞死因子α

組別 只數(shù) TRAP染色陽性面積(%)平均光密度值IL－1β IL－6 TNF－α TNF－α水平(pg/ml).005 88.52±1.59聚乙烯組 8 5.27±1.53 0.145±0.013 0.105±0.020 0.169±0.015 144.32±4.94紗布組 8 4.90±2.09 0.152±0.014 0.114±0.015 0.199±0.018 166.58±5.69 F對(duì)照組 8 1.16±0.45 0.115±0.006 0.057±0.013 0.099±0值＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 17.93 23.39 28.40 122.22 653.97 P值

圖2 各組小鼠顱骨骨片TRAP染色結(jié)果 (×200)Figure 2 Result of mice calvarial TRAP staining in each group

圖3 各組小鼠囊壁組織免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 (×100)Figure 3 Result of Immunohistochemical staining of air pouch wall tissue in each group

3 討論

在假體磨碎碎屑中，數(shù)量最多的當(dāng)屬聚乙烯顆粒［6］，是公認(rèn)的生物活性最強(qiáng)的碎屑顆粒，因此，本研究以聚乙烯顆粒為參考，作為確定能引起炎性骨溶解的“金標(biāo)準(zhǔn)”，以確定紗布纖維是否能引起相同的炎性骨溶解。

在人工關(guān)節(jié)無菌性松動(dòng)中，磨損碎屑引起的巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞分泌的大量的炎性遞質(zhì)是假體周圍骨溶解的“導(dǎo)火索”。研究表明，炎性遞質(zhì)IL－1β、IL－6、TNF－α主要是促進(jìn)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化成熟進(jìn)而產(chǎn)生溶骨作用，該過程主要通過破骨細(xì)胞“OPG/OPGL(RANKL)/RANK”信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路完成。OPGL通過與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞膜上的RANK結(jié)合，導(dǎo)致破骨細(xì)胞前體細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化成熟，而OPG作為OPGL的偽受體與之結(jié)合而抑制破骨細(xì)胞的分化成熟［7］。IL－1β和TNF－α能直接促進(jìn)OPGL的生成增多，從而使更多的破骨細(xì)胞成熟，產(chǎn)生骨溶解效應(yīng)［8］。IL－6促進(jìn)破骨細(xì)胞的成熟的同時(shí)還能作用于巨噬細(xì)胞本身，使其產(chǎn)生更多的IL－6而引起骨溶解效應(yīng)［9］。因此，本研究選擇 IL－1β、IL－6、TNF－α作為骨溶解效應(yīng)的標(biāo)志。

本研究采用的動(dòng)物模型是人工關(guān)節(jié)無菌性松動(dòng)研究中經(jīng)典的病理模型，能較好地模擬人工關(guān)節(jié)松動(dòng)的病理過程，且成本低、周期短、可重復(fù)性高［10］，較為理想。

無菌性松動(dòng)通常發(fā)生在骨與假體間的界膜或假體表面，異物顆?？梢娪诮M織細(xì)胞或巨細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)或細(xì)胞外，常伴有不同程度的淋巴細(xì)胞浸潤［11－13］。界膜組織中，單核巨噬細(xì)胞約占70%，當(dāng)其吞噬周圍磨損碎屑后，會(huì)釋放大量的炎性遞質(zhì)如IL－1β、IL－6、TNF－α等，界膜組織中的多核巨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞也會(huì)促進(jìn)炎性遞質(zhì)釋放［14－15］。有研究表明，界膜組織實(shí)質(zhì)就是以巨噬細(xì)胞為主，多種細(xì)胞共同參與的異物肉芽腫性炎［16］。松動(dòng)假體周圍的結(jié)締組織膜具有異物肉芽腫的特征，異物所致慢性肉芽腫主要是以滲出的單核細(xì)胞與巨噬細(xì)胞為主，包含異物巨細(xì)胞［17］。Udagawa等［18］研究發(fā)現(xiàn)，界膜中的破骨細(xì)胞在抗原和功能上均與成熟巨噬細(xì)胞相似，并可在合適的刺激因子作用下由巨噬細(xì)胞前體衍化生成。因此，筆者聯(lián)想到紗布纖維引起的異物反應(yīng)與常見的無菌性松動(dòng)的界膜炎癥反應(yīng)有著很多相似之處，異物反應(yīng)中的巨噬細(xì)胞有可能在某些微環(huán)境作用下成為破骨細(xì)胞進(jìn)而產(chǎn)生骨溶解效應(yīng)。

本研究首先模擬紗布擦拭骨表面的真實(shí)過程，確定了術(shù)中紗布纖維殘留的可能性，且干紗布造成的殘留量高于濕紗布，而小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示紗布纖維可引起氣囊內(nèi)炎性因子的釋放增加，減少紗布纖維的殘留對(duì)減少炎性因子導(dǎo)致的炎性骨溶解有直接作用。而將與聚乙烯顆粒等重量的紗布纖維植入小鼠氣囊后，聚乙烯組和紗布組小鼠囊壁組炎癥反應(yīng)程度、炎性細(xì)胞滲出量、蛋白表達(dá)水平、炎性遞質(zhì)mRNA及顱骨骨片破骨細(xì)胞特異性染色程度均強(qiáng)于對(duì)照組小鼠，且紗布組TNF－α蛋白表達(dá)水平高于聚乙烯組，說明紗布纖維與聚乙烯顆粒一樣，可引起假體周圍組織炎性因子的釋放增加，產(chǎn)生炎性骨溶解。但紗布組和聚乙烯組小鼠HE染色、TRAP染色及免疫組化染色結(jié)果并無顯著性差異，且本研究中采用的動(dòng)物數(shù)量較少，斷然做出紗布纖維較聚乙烯顆粒的生物活性更強(qiáng)的結(jié)論有些欠妥，其具體的更深入的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，術(shù)中使用紗布要慎重，尤其應(yīng)避免使用干紗布，以免留下大量的紗布纖維。建議使用濕紗布以減少纖維的殘留，或采用新型表面干燥措施。

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