纈沙坦對(duì)尿酸性腎病大鼠腎間質(zhì)纖維化的干預(yù)機(jī)制研究

孔翠文，閆 慧，李 靖，楊 堃，王 艷

尿酸性腎病是因血尿酸升高，尿酸鹽晶體在腎臟沉積引起的病變，可導(dǎo)致腎小管間質(zhì)纖維化。研究表明，慢性缺氧是導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化的重要因素［1］，目前尿酸性腎病大鼠是否存在缺氧狀態(tài)及纈沙坦對(duì)其缺氧狀態(tài)的影響少有報(bào)道。缺氧誘導(dǎo)因子－1α (hypoxia－inducible factor－1α，HIF－1α) 是組織缺氧時(shí)重要核轉(zhuǎn)錄因子，是缺氧的可靠標(biāo)記物［2］。腎臟缺氧的基礎(chǔ)是腎小管周圍毛細(xì)血管 (peritubular capillaries，PTC)進(jìn)行性減少［3］，而血小板反應(yīng)蛋白 －1(thrombospondin－1，TSP－1)是強(qiáng)烈的抑制血管生成因子［4］。本研究通過酵母和腺嘌呤建立尿酸性腎病大鼠模型，觀察腎臟TSP－1、HIF－1α的動(dòng)態(tài)表達(dá)，探討其是否存在缺氧機(jī)制及纈沙坦可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性健康Wistar大鼠 (購(gòu)于山東魯抗實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)36只，體質(zhì)量 (190±10)g，飼養(yǎng)于青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)房。

1.1.2 試劑 纈沙坦 (北京諾華制藥有限公司)，Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) (RT－PCR)試劑盒、Premix Ex Taq(大連寶生物工程有限公司)，兔抗大鼠HIF－1α、TSP－1多克隆抗體及DAB顯色試劑、Masson三色染色試劑盒 (福州邁新)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型 36只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組和纈沙坦組，每組12只。用10%酵母飼料喂養(yǎng)和腺嘌呤100 mg·kg－1·d－1灌胃造模。纈沙坦組在造模同時(shí)加用纈沙坦30 mg·kg－1·d－1灌胃治療。正常組用普通飼料喂養(yǎng)，用與纈沙坦組等容積的蒸餾水灌胃。

1.2.2 標(biāo)本收集與檢測(cè) 3組大鼠均在入組后第3周、5周時(shí)于代謝籠中留取24 h尿液，每組處死6只大鼠，內(nèi)眥靜脈采血，摘取腎臟，稱重后縱切，一份固定于4%多聚甲醛溶液，常規(guī)石蠟包埋;另一份放入液氮中用于RT－PCR。全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血尿酸 (UA)、血肌酐 (Scr)。

1.2.3 腎組織病理 石蠟切片行常規(guī)蘇木素－伊紅染色法(HE)和Masson染色，于高倍鏡下，每張切片隨機(jī)采集10個(gè)腎皮質(zhì)區(qū)域互不重疊的視野 (均不含腎小球和較大小動(dòng)脈)，應(yīng)用JD801形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)Version 1.0分析，腎間質(zhì)纖維化相對(duì)面積=腎間質(zhì)陽(yáng)性染色面積/腎小管間質(zhì)總面積 (腎小管管腔除外) ×100%，并取平均值。

1.2.4 腎組織TSP－1 mRNA和HIF－1α mRNA水平檢測(cè) 根據(jù)Trizol說明書提取腎臟總RNA，并依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA。取 1 μl cDNA為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增 (終體系20 μl)。引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度見表1。反應(yīng)條件:預(yù)變性，95℃ 5 min，1個(gè)循環(huán);PCR反應(yīng)，98℃10 s，60℃30 s，72℃30 s，40個(gè)循環(huán)，72℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物定量:產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化已錠染色，凝膠成像系統(tǒng)掃描DNA條帶，并應(yīng)用Quantity One 4.6軟件分析灰度值。各組基因相對(duì)表達(dá)量以目的基因/β－actin的灰度比值來表示。

表1 RT－PCR引物序列Table 1 Primer sequences of RT－PCR

1.2.5 腎臟免疫組織化學(xué)法檢查 常規(guī)脫蠟，SP法檢測(cè)腎組織TSP－1、HIF－1α表達(dá)，具體步驟按試劑盒說明書進(jìn)行，以腎實(shí)質(zhì)及間質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)棕褐色顆粒為陽(yáng)性著色，采集及分析切片圖像信息，方法同Masson染色，腎小管間質(zhì)相對(duì)陽(yáng)性面積=腎小管間質(zhì)陽(yáng)性染色面積/腎小管間質(zhì)總面積 (去除腎小管管腔) ×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以 (±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用SNK法檢驗(yàn);兩指標(biāo)間的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠的體質(zhì)量及血生化指標(biāo)水平 3組大鼠3周和5周時(shí)測(cè)得的體質(zhì)量、UA、Scr水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。模型組和纈沙坦組與對(duì)照組比較，大鼠3周、5周時(shí)的體質(zhì)量、UA、Scr水平間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);纈沙坦組與模型組比較，大鼠3周和5周時(shí)的體質(zhì)量、Scr水平間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01，見表2)。

2.2 腎臟病理學(xué)

2.2.1 病理改變 正常組大鼠腎臟基本正常，HE染色、Masson染色顯示膠原主要位于腎小管基底膜、Bowman囊等處(見圖1A、圖2A)。(2)模型組大鼠3周時(shí)腎小球輕度腫大，腎小管上皮細(xì)胞輕度萎縮并有空泡變性，間質(zhì)可見大量單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，可見藍(lán)染的膠原纖維;5周時(shí)可見尿酸鹽晶體，腎小管上皮萎縮，藍(lán)染膠原纖維明顯增多 (見圖1B、圖2B)。(3)與模型組相比，纈沙坦組腎臟尿酸鹽晶體明顯減少，纖維化程度減輕 (見圖1C、圖2C、表3)。

2.2.2 免疫組織化學(xué) 3組大鼠3周和5周時(shí)測(cè)得的腎臟HIF－1α、TSP－1表達(dá)量間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。模型組、纈沙坦組的表達(dá)量均高于正常組，模型組的表達(dá)量亦高于纈沙坦組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05，見表3)。正常組腎臟HIF－1α僅在皮髓質(zhì)交界處腎小管上皮細(xì)胞散在表達(dá);模型組和纈沙坦組HIF－1α的表達(dá)量增加，主要位于腎小管上皮細(xì)胞和間質(zhì)成纖維細(xì)胞、炎細(xì)胞的胞核和胞質(zhì) (見圖3)。正常組腎臟TSP－1僅少量表達(dá)于腎小球壁層和腎間質(zhì)。模型組和纈沙坦組TSP－1的表達(dá)量增加，廣泛表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞的胞質(zhì) (見圖4)。

2.3 RT－PCR結(jié)果 3組大鼠3周和5周時(shí)RT－PCR測(cè)得的TSP－1 mRNA、HIF－1α mRNA表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。模型組和纈沙坦組3周和5周時(shí)TSP－1 mRNA、HIF－1α mRNA的表達(dá)量均高于正常組，模型組3周和5周時(shí)TSP－1 mRNA、HIF－1α mRNA的表達(dá)量亦均高于纈沙坦組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05，見圖5、圖6)。

圖1 5周后3組大鼠HE染色結(jié)果 (×200)Figure 1 HE staining of three groups at 5 week

圖2 5周后3組大鼠Masson染色結(jié)果 (×400)Figure 2 Masson staining of three groups at 5 week

圖3 5周后3組大鼠HIF－1α免疫組織化學(xué)結(jié)果 (×400)Figure 3 HIF－1α expression by immunohistochemistry of three groups at 5 week

圖4 5周后3組大鼠TSP－1免疫組織化學(xué)結(jié)果 (×400)Figure 4 TSP－1 expression by immunohistochemistry of three groups at 5 week

2.4 相關(guān)性分析 模型組大鼠3周和5周時(shí)腎組織TSP－1 mRNA與HIF－1α mRNA的表達(dá)分別呈正相關(guān) (r值分別為0.821和0.736，P＜0.05)。

表2 3組大鼠的體質(zhì)量及血生化指標(biāo)水平比較 (±s)Table 2 Comparison of body mass and biochemical indexes of rats in three groups

表2 3組大鼠的體質(zhì)量及血生化指標(biāo)水平比較 (±s)Table 2 Comparison of body mass and biochemical indexes of rats in three groups

注:UA=血尿酸，Scr=血肌酐;與正常組比較，△P＜0.05;與模型組比較，▲P＜0.05

組別 只數(shù) 體質(zhì)量(g)3周 5周UA(μmol/L)3周 5周Scr(μmol/L)3周 5周正常組 12 332±16 428±24 81±10 78±13 26± 7 28± 8模型組 12 288±24△ 242±37△ 135±32△ 124±14△ 112±27△ 177±23△纈沙坦組 12 301±25△▲ 345±29△▲ 133±19△ 127±18△ 82±15△▲ 138±21△▲F 值＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 383.60 160.01 41.22 136.50 214.58 172.98 P值

表3 3組大鼠Masson染色面積比及HIF－1α和TSP－1表達(dá)比較 (x ± s，%)Table 3 Comparison of Masson staining and expression of HIF－1α，TSP－1 in three groups

圖5 3組大鼠TSP－1 mRNA相對(duì)表達(dá)量Figure 5 Comparison of levels of TSP－1 mRNA of rats in three groups

圖6 3組大鼠HIF－1α mRNA相對(duì)表達(dá)量Figure 6 Comparison of levels of HIF－1α mRNA of rats in three groups

3 討論

腎間質(zhì)纖維化是各種腎臟疾病進(jìn)行性發(fā)展的共同轉(zhuǎn)歸，尿酸性腎病也不除外。腎間質(zhì)纖維化機(jī)制目前認(rèn)為是多種細(xì)胞因子參與的復(fù)雜過程。近年來PTC丟失及組織缺氧在腎間質(zhì)纖維化中的作用日益引起人們的重視。研究表明，以小管間質(zhì)病變?yōu)橹鞯哪I臟疾病由于水腫、炎癥等會(huì)直接影響血流和氧的供應(yīng)［5－6］。HIF－1是由 HIF－1α 和 HIF －1β 組成的異二聚體復(fù)合物，HIF－1α在低氧環(huán)境中穩(wěn)定表達(dá)［2］，是反映低氧狀態(tài)的敏感指標(biāo)。本研究采用酵母和腺嘌呤建立尿酸性腎病大鼠模型，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠腎臟HIF－1α表達(dá)水平明顯升高，表明尿酸性腎病大鼠腎臟存在缺氧狀態(tài)。

TSP－1是一種內(nèi)源性的強(qiáng)烈抑制血管生成因子，且高表達(dá)于整個(gè)腎纖維化過程中［7］。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腎臟TSP－1表達(dá)水平亦明顯升高，且與HIF－1α的表達(dá)水平呈正相關(guān)。腎間質(zhì)纖維化機(jī)制可能與TSP－1表達(dá)增加進(jìn)而抑制血管生成，PTC密度減少，組織缺氧狀態(tài)加重有關(guān)。尿酸可激活腎素－血管緊張素系統(tǒng) (RAS)，改變腎臟血流動(dòng)力學(xué)，升高球內(nèi)壓，并可直接促進(jìn)腎臟纖維化進(jìn)展［8］。血管緊張素受體拮抗劑 (ARB)因可降低血壓，減少尿蛋白而起到腎臟保護(hù)作用，臨床上常用于慢性腎臟病的治療［9－10］，但其分子機(jī)制尚未完全明確。研究發(fā)現(xiàn)血管緊張素Ⅱ可降低PTC密度，ARB奧美沙坦可以改善PTC減少引起的組織缺氧［11］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，纈沙坦干預(yù)治療3周后，腎間質(zhì)纖維化程度減輕，TSP－1、HIF－1α表達(dá)較模型組均有所降低;5周后腎間質(zhì)纖維化程度明顯改善，TSP－1、HIF－1α表達(dá)較3周時(shí)升高，但均比模型組降低。本研究結(jié)果表明，尿酸性腎病大鼠腎間質(zhì)纖維化與TSP－1表達(dá)增多導(dǎo)致微血管丟失，加重組織缺血缺氧有關(guān)。纈沙坦可能通過減少微血管丟失、改善腎臟缺氧狀態(tài)從而起到保護(hù)腎臟的作用。

1 Nangaku M.Chronic hypoxia and tubulointerstitial injury:a final common pathway to end － stage renal failure ［J］.J Am Soc Nephrol，2006，17(1):17－25.

2 Stravodimos KG，Koritsiadis G，Lazaris AC，et al.Hydronephrosis promotes expression of hypoxia－ inducible factor－1 alpha［J］.Urol Int，2009，82(1):38－42.

3 Ohashi R，Shimizu A，Masuda Y，et al.Peritubular capillary regression during the progression of experimental obstructive nephropathy［J］.J Am Soc Nephrol，2002，13(7):1795 －1805.

4 Motegi K，Harada K，Pazouki S，et al.Evidence of a bi－phasia effect of thrombospondin－1 on angiogenesis［J］.Histochem J，2002，34(8/9):411－421.

5 Fine LG，Orphanides C，Norman JT.Progressive renal disease:the chronic hypoxia hypothesis ［J］.Kidney Int，1998，65(Suppl):s74－s78.

6 Fine LG，Bandyopadhay D，Norman JT.Is there a common mechanism for the progression of different types of renal diseases other than proteinuria?Towards the unifying theme of chronic hypoxia ［J］.Kidney lnt，2000，75(Suppl):s22－s26.

7 Sanchez AP，Sharma K.TranScription factors in the pathogenesis of diabetic nephropathy［J］.Expert Rev Mol Med，2009，28(11):e13.

8 Kang DH，Nakagawa T，F(xiàn)eng L，et al.A role for uric acid in the progression of renal disease［J］.J Am Soc Nephrol，2002，13(12):2888－2897.

9 王愛坤.纈沙坦對(duì)糖尿病腎病的保護(hù)作用研究［J］.實(shí)用心腦肺血管病雜志，2011，19(9):1513.

10 王曉東，李紅濤，包春艷，等.瑞舒伐他汀鈣聯(lián)合纈沙坦治療早期糖尿病腎病療效觀察 ［J］.中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2011，14(11):3787.

11 Shao J，Nangaku M，Miyata T，et al.Imbalance of T－cell subsets in angiotensinⅡ －infused hypertensive rats with kidney injury［J］.Hypertension，2003，42(1):31－38.