宮頸癌性別決定基因9基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平檢測(cè)對(duì)宮頸癌的價(jià)值研究

巫劍紅，田玉翠，萬(wàn)治安，代蔭梅

宮頸癌的發(fā)病率僅次于乳腺癌，居女性惡性腫瘤第2位，是最常見的女性生殖道惡性腫瘤之一［1］。人乳頭瘤病毒 (human papillomavirus，HPV)感染被認(rèn)為是宮頸癌病因?qū)W最重要的危險(xiǎn)因素。但HPV感染只是宮頸癌發(fā)生的必需但不充分病因，即在宮頸癌的自然形成過(guò)程中尚需要其他輔助因素的參與，但其誘導(dǎo)宮頸癌變發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)制尚不明確［2］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，很多基因的甲基化與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，比如 p16、MGMT、PAX1 和 RASSF1A［3－5］。性別決定基因9(sex determining region Y－box 9，SOX9)最早是從一種性別反轉(zhuǎn)畸形的遺傳性疾病——Campomellic dysplasia(CD)患者中克隆得到的，是軟骨及其他組織包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)及泌尿生殖系統(tǒng)中的表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子。SOX9可通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮腫瘤抑制作用，并可抑制癌胚抗原的表達(dá)［6］。目前研究表明，在膀胱癌［7］、濾泡性淋巴瘤［8］、套細(xì)胞淋巴瘤［9］和乳腺癌［10］等腫瘤中均可檢測(cè)到 SOX9基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化，本研究采用雙探針定量檢測(cè)宮頸脫落細(xì)胞SOX9基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平，探索其作為分子標(biāo)記物在宮頸癌診斷、治療和預(yù)后評(píng)估中的作用。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 采集2010年3月—2011年1月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院正常宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本 (正常宮頸組)和宮頸癌脫落細(xì)胞標(biāo)本 (宮頸癌組)，各48例。正常宮頸組年齡25～65歲，平均 (39.5±9.5)歲。宮頸癌組年齡21～73歲，平均 (41.0±11.2)歲。按照宮頸癌的國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)分期 (2009)宮頸癌患者中Ⅰ期20例、Ⅱ期22例、Ⅲ期6例，鱗狀細(xì)胞癌43例、腺癌5例，細(xì)胞學(xué)分級(jí)G1～G235例、G313例。所有標(biāo)本經(jīng)病理檢查確診。均無(wú)其他腫瘤罹患證據(jù)，術(shù)前未接受放、化療。

1.2 試劑與儀器 基因組DNA提取試劑盒 (博爾誠(chéng)北京科技有限公司，Cat#K5016005);DNA甲基化檢測(cè)試劑盒 (博爾誠(chéng)北京科技有限公司，Cat#K5082100);引物和探針 (由博尚生物技術(shù)有限公司合成);離心機(jī) (Eppendorf，Centrifuge 5430R);PCR 儀 (Applied Biosystems，7500 Real Time PCR System)。

1.3 樣本采集 采用新柏氏液基薄層細(xì)胞學(xué)檢測(cè)收集系統(tǒng)采集標(biāo)本。采集方法:擦去宮頸上的黏液，將宮頸刷插入子宮頸內(nèi)，順時(shí)針?lè)较蛐D(zhuǎn)5圈，采集宮頸鱗柱交界處及頸管的脫落細(xì)胞，將收集的細(xì)胞洗入保存液中。宮頸刷攪拌約10次，使細(xì)胞充分進(jìn)入保存液。旋緊瓶蓋，做好標(biāo)本標(biāo)識(shí)，置于4℃冰箱保存。采用新建立的Taqman探針聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (polymerase chain reaction，PCR)甲基化水平檢測(cè)方法，測(cè)定宮頸癌脫落細(xì)胞和正常宮頸脫落細(xì)胞中SOX9基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平。

1.4 定量PCR檢測(cè) 收集的標(biāo)本置50 ml離心管，8 000 r/min離心15 min，棄去上清液，按基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明提取脫落細(xì)胞的基因組DNA。按照DNA甲基化檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書步驟對(duì)DNA進(jìn)行亞硫酸鹽修飾，修飾后的DNA置于－20℃冰箱保存。定量PCR反應(yīng)的引物及探針由博尚生物技術(shù)有限公司合成。PCR引物:上游引物5'－GTATTAATTATAGGAGYGGTTGG－3'，下游引物 5'－TCTATTCCAATTCCCCAAACC－3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為105 bp;探針:檢測(cè)甲基化SOX9基因的探針序列:Methy 5'－FAM－TTCGCGATACGGGGATTTGTTT－BHQ1－3';檢測(cè)非甲基化SOX9基因的探針序列:Unmethy 5'－HEX－TGGGAGTTTGTGATATGGGGATTTBHQ1－3'。PCR擴(kuò)增采用羅氏PCR反應(yīng)體系 (20 μl):2×LightCycler480 Probes Master(Roche Scientific，Cat#4887301001)10.0 μl，上下游混合引物 (10 μm)1.0 μl，探針 (5 μm)1.0 μl，dH2O 7.0 μl，DNA 模板 1.0 μl。反應(yīng)條件:94℃ 3 min;(94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s) ×45個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增時(shí)以正常宮頸脫落細(xì)胞DNA樣本作正常對(duì)照，以等量去離子雙蒸水代替模板DNA作陰性對(duì)照。

1.5 甲基化水平的表示方法 臨床宮頸癌脫落細(xì)胞樣本中除了含有腫瘤細(xì)胞，還含有炎癥細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、結(jié)締組織等非腫瘤細(xì)胞。因此脫落細(xì)胞DNA同時(shí)存在來(lái)自腫瘤細(xì)胞甲基化的SOX9基因和來(lái)自非腫瘤組織非甲基化SOX9基因。為了定量獲得組織樣本SOX9基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化和非甲基化的比率，采用了甲基化分值 (methylation score，MS)來(lái)表示甲基化水平:

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以 (±s)表示，采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組MS比較 宮頸癌和正常宮頸脫落細(xì)胞樣本的SOX9基因啟動(dòng)子區(qū)平均 MS分別為 (47.7±24.7)和 (11.4±5.0)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=10.048，P=0.000)。

2.2 宮頸癌病理特征與MS的關(guān)系 宮頸癌組中鱗癌SOX9基因啟動(dòng)子區(qū)MS高于腺癌，G3高于G1～G2，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的，有脈管癌栓的高于無(wú)脈管癌栓的，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05，見表1)。

表1 宮頸癌病理特征與MS的關(guān)系Table 1 Relationship between pathological features and MS in cervical cancer

3 討論

DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要研究?jī)?nèi)容，其在維持正常細(xì)胞功能、遺傳印記、胚胎發(fā)育以及人類腫瘤發(fā)生中起著重要作用。在真核生物基因組中約80%的CpG位點(diǎn)被甲基化，這些甲基化主要發(fā)生在基因啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島［11］。DNA甲基化異?？赏ㄟ^(guò)影響染色體結(jié)構(gòu)以及癌基因和抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)表達(dá)而參與腫瘤的形成。抑癌基因的啟動(dòng)子區(qū)甲基化與某些腫瘤的臨床分期和病理特征緊密相關(guān)，逐漸成為腫瘤診斷、治療和預(yù)后評(píng)估的分子標(biāo)志物［12－13］。

目前檢測(cè)基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化大多采用甲基化特異性PCR法［14］和熒光定量PCR［15］。本研究針對(duì)靶基因 SOX9基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)和非甲基化狀態(tài)各設(shè)計(jì)了Taqman探針，利用雙探針在同一個(gè)反應(yīng)管中測(cè)定SOX9基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化和非甲基化狀態(tài)的比例，建立了評(píng)估SOX9基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平的一種定量檢測(cè)方法。

SOX9是軟骨細(xì)胞及多種組織如中樞神經(jīng)系統(tǒng)和泌尿生殖系統(tǒng)組織的轉(zhuǎn)錄因子［16－17］。SOX9可區(qū)分間質(zhì)軟骨肉瘤和其他骨細(xì)胞腫瘤［18］，可調(diào)節(jié)維甲酸類介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)［19］。在前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌和膀胱癌中發(fā)現(xiàn)SOX9的腫瘤抑制作用［6，19－21］。SOX9基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的研究有助于了解SOX9在這些腫瘤中參與腫瘤抑制和腫瘤進(jìn)展的分子生物學(xué)機(jī)制。本研究也顯示，宮頸癌標(biāo)本的SOX9基因啟動(dòng)子區(qū)MS就明顯高于正常宮頸標(biāo)本，提示甲基化SOX9可能用于宮頸癌的分子生物學(xué)診斷。

另外本研究還顯示，在宮頸癌組中SOX9基因啟動(dòng)子區(qū)MS宮頸鱗癌中高于腺癌，且高細(xì)胞學(xué)分級(jí)比低細(xì)胞學(xué)分級(jí)高，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和有脈管癌栓的明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管癌栓的，提示SOX9基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與宮頸癌的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，且可能作為宮頸癌預(yù)后不良的分子標(biāo)記物。這與國(guó)外學(xué)者在其他腫瘤中對(duì)SOX9基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的研究結(jié)果相同。Aleman等［7］對(duì)101例膀胱癌的研究中發(fā)現(xiàn)SOX9基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化發(fā)生在56.4%的膀胱癌中，是膀胱癌的頻繁事件，具有腫瘤特異性。Sun等［22］在胃癌中研究發(fā)現(xiàn)SOX9基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度與胃癌分期、血管浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和人類皰疹病毒感染呈正相關(guān)。Enjuanes等［9］研究發(fā)現(xiàn)在套細(xì)胞淋巴瘤中SOX9基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平高與腫瘤細(xì)胞增殖速度快、染色體異常和患者生存時(shí)間短呈正相關(guān)，提示SOX9基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化可作為胃癌預(yù)后的分子標(biāo)記物。而本研究發(fā)現(xiàn)，SOX9基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與宮頸細(xì)胞學(xué)分級(jí)、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管癌栓密切相關(guān)，而這三者對(duì)于宮頸癌的進(jìn)一步治療如再次手術(shù)、放療和化療等具有重要的指導(dǎo)意義，因此SOX9基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化可用于指導(dǎo)宮頸癌的治療。

SOX9基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化不僅與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，還可以用于指導(dǎo)宮頸癌的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估。甲基化SOX9可能為未來(lái)宮頸癌的治療靶點(diǎn)之一。本研究建立的DNA甲基化雙探針技術(shù)平臺(tái)，只要更換引物和探針，還可以方便地應(yīng)用于其他基因的甲基化檢測(cè)，為臨床標(biāo)本的分子生物學(xué)研究提供了可靠的技術(shù)支持，是甲基化檢測(cè)未來(lái)的發(fā)展方向。

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