兩種乳酸菌發(fā)酵液對人胃癌細(xì)胞株BGC823體外增殖及小鼠免疫功能的影響

牛 瓊，馬 云，杜鎮(zhèn)鎮(zhèn)，張 珍

(1 濱州醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院，山東濱州 256603;2 濱州醫(yī)學(xué)院病原免疫實(shí)驗(yàn)室)

乳酸菌(LAB)是人體消化道及生殖道內(nèi)的一組正常菌群，有助于維持微生態(tài)的平衡與健康，其發(fā)酵碳水化合物過程中產(chǎn)生的酸性代謝產(chǎn)物、胞外多糖、γ-氨基丁酸等具有提高機(jī)體免疫力、抗感染、抗腫瘤等作用［1］。早在 20 世紀(jì) 80 年代，Oda等［2］即發(fā)現(xiàn)瑞士乳桿菌約古特亞種產(chǎn)生的胞外多糖(EPS)具有抑制腫瘤活性的作用;張?bào)薜龋?］亦報(bào)道保加利亞乳桿菌EPS對人癌細(xì)胞有抑制作用，但有關(guān)LAB發(fā)酵液(各種代謝產(chǎn)物混合體)的抑癌作用鮮見報(bào)道。2012年1～4月，我們觀察了LAB發(fā)酵液對人胃癌細(xì)胞株BGC823體外增殖及小鼠免疫功能的影響，旨在為腫瘤防治提供依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器 ①菌種與細(xì)胞株:保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus，Lb.)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus，St.)、MRS 培養(yǎng)基，均購于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物研究所;人胃癌BGC823細(xì)胞株購于煙臺大學(xué)藥學(xué)院。②動物:昆明系小鼠、Balb/c小鼠、豚鼠(雌雄兼用)，均購于山東大學(xué)動物中心。③儀器:包括電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠);氣浴恒溫振蕩器(江蘇榮華儀器);全自動高壓滅菌器(日本三洋電器);生物安全柜(上海博迅實(shí)業(yè));細(xì)胞培養(yǎng)箱、全自動酶標(biāo)儀、離心機(jī)(均為賽默飛世爾科技公司)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 LAB的培養(yǎng)與發(fā)酵液的制備 將 Lb.和St.兩種菌株分別用MRS液體培養(yǎng)基連續(xù)活化3代，用無菌PBS緩沖液洗滌細(xì)菌，調(diào)整密度為3×108mL。按2%體積量向MRS液體培養(yǎng)基接種，搖勻、密閉封口，37℃氣浴恒溫振蕩器中發(fā)酵;1周后，取發(fā)酵液以4000 r/min離心30 min，對上清用0.2 μm的微孔濾膜過濾器過濾除菌，調(diào)節(jié)pH值至7.2，分裝凍存?zhèn)溆茫?］。

1.2.2 人胃癌BGC823細(xì)胞增殖活性測定 取對數(shù)生長期BGC823細(xì)胞隨機(jī)分為Lb.組、St.組、混合組和對照組，均按5×105/mL的密度接種于96孔板中，每孔均加入RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)100 μL，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，去除上清;前三組分別加入Lb.發(fā)酵液、St.發(fā)酵液及兩者1∶1混合發(fā)酵液各200 μL(發(fā)酵液與細(xì)胞培養(yǎng)液按1∶4體積比)，對照組加入PBS緩沖液200 μL(與細(xì)胞培養(yǎng)液體積比同上)，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入四氮唑藍(lán)(MTT)溶液10 μL，4 h后洗棄上清、加二甲基亞砜150 μL［5］，每組至少6 個(gè)平行孔，用酶標(biāo)儀測定570 nm波長處各組的光密度(OD)值。

1.2.3 小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DHT)實(shí)驗(yàn)及脾臟質(zhì)量、指數(shù)檢測 ①DHT實(shí)驗(yàn):取40只昆明系小鼠隨機(jī)分為Lb.組、St.組、混合組和對照組各10只，前三組分別予Lb.發(fā)酵液、St.發(fā)酵液、兩菌1∶1混合發(fā)酵液及生理鹽水灌胃，0.8 mL/次、1 次/d ×8 d，第 3天在小鼠左足墊注射0.5%的綿羊紅細(xì)胞懸液0.2 mL，第7天用游標(biāo)卡尺測量小鼠的左足墊厚度并再次注射0.5%的綿羊紅細(xì)胞懸液0.2 mL，第8天(攻擊24 h后)測定左足墊的厚度，取兩次足墊厚度差值作為DHT指標(biāo)［6］。②脾臟質(zhì)量、指數(shù)檢測:取DHT實(shí)驗(yàn)完畢小鼠，逐個(gè)稱重，眼球放血致死，解剖取脾臟稱重，計(jì)算脾臟指數(shù)［脾臟質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)］［7］。

1.2.4 脾細(xì)胞產(chǎn)生抗體溶血素檢測 取40只Balb/c小鼠隨機(jī)分為 Lb.組、St.組、混合組和對照組各10只，同上灌胃，連續(xù)7 d;第7天開始腹腔注射0.5%綿羊紅細(xì)胞0.2 mL進(jìn)行免疫，連續(xù)7 d，末次注射40 min后自眼球取血，3000 r/min離心5 min，將血清稀釋100倍后取0.5 mL與1%綿羊紅細(xì)胞和1∶30補(bǔ)體(豚鼠血清)各0.5 mL混合，在37℃恒溫箱中反應(yīng)30 min、0℃冰浴30 min終止反應(yīng);離心取上清，在540 nm波長處測OD值，用生理鹽水加入補(bǔ)體反應(yīng)體系作空白對照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)以表示，組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組BGC823細(xì)胞增殖活性 Lb.組、St.組、混合組不同時(shí)點(diǎn)BGC823細(xì)胞增殖活性均略低于對照組，其中混合組略低于Lb.組、St.組，但組間比較均無顯著差異。詳見表1。

表1 各組BGC823細(xì)胞增殖活性比較(OD值，)

表1 各組BGC823細(xì)胞增殖活性比較(OD值，)

BGC823組別 細(xì)胞增殖活性24 h 48 h 72 h Lb.組0.409 ±0.022 0.667 ±0.013 0.780 ±0.022 St.組 0.412 ±0.021 0.680 ±0.017 0.764 ±0.018混合組 0.396 ±0.037 0.653 ±0.023 0.746 ±0.009對照組0.428 ±0.013 0.678 ±0.021 0.802 ±0.017

2.2 各組免疫功能指標(biāo) 見表2。

3 討論

表2 各組免疫功能指標(biāo)比較()

表2 各組免疫功能指標(biāo)比較()

注:與對照組相比，*P ＜0.05，ΔP ＜0.01

組別 足墊厚度差值(mm) 脾臟質(zhì)量(mg) 脾臟指數(shù) 抗體溶血素(OD值)Lb.組 0.23 ±0.04* 0.121 ±0.009* 6.05 ±0.80* 0.341 ±0.023*St.組 0.24 ±0.01* 0.122 ±0.012* 6.35 ±1.07* 0.362 ±0.019*混合組 0.24 ±0.03* 0.127 ±0.010* 6.55 ±0.92* 0.405 ±0.035Δ對照組 0.21 ±0.01 0.118 ±0.011 5.90 ±0.95 0.336 ±0.027

胃癌是人類常見的腫瘤，目前基本采取以手術(shù)為主的綜合治療方法，但易于復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移、預(yù)后較差［8］。如何運(yùn)用天然食物或人體腸道有益菌及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行腫瘤的防治為目前國際上的重點(diǎn)研究課題。LAB在調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)學(xué)中具有重要的地位，目前在輕工、食品、醫(yī)藥及飼料等許多行業(yè)都有廣泛的應(yīng)用，其發(fā)酵液具有制備簡單、安全性高、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)［1］。劉宇［9］報(bào)道，LAB 代謝產(chǎn)物 EPS體外對胃癌、腸癌細(xì)胞均有明顯抑制作用，且劑量、時(shí)間與效應(yīng)呈正相關(guān)。本研究顯示，Lb.組、St.組、混合組不同時(shí)點(diǎn)BGC823細(xì)胞增殖活性均略高于對照組，其中混合組略低于Lb.組、St.組，但組間比較均無顯著差異?？赡茉?yàn)楸狙芯克冒l(fā)酵液中對胃癌細(xì)胞具有增殖抑制作用的成分含量或濃度太低，以后研究需濃縮發(fā)酵液，進(jìn)一步明確各成分及其作用機(jī)理。

DHT是抗原誘導(dǎo)的一種細(xì)胞性免疫應(yīng)答，即效應(yīng)T細(xì)胞與特異性抗原結(jié)合作用后，引起的以單核細(xì)胞浸潤和組織損傷為主要特征的炎癥反應(yīng)［10］，此超敏反應(yīng)因發(fā)生較慢，通常在接觸相同抗原后24～72 h出現(xiàn)炎癥反應(yīng)而得名，廣泛用來測定活體內(nèi)的細(xì)胞免疫水平，評估免疫系統(tǒng)的能力。脾臟為機(jī)體最大的免疫器官(與免疫力的產(chǎn)生密切相關(guān))，含有大量免疫細(xì)胞，其中T淋巴細(xì)胞約占40%、B淋巴細(xì)胞約占60%，脾臟質(zhì)量與指數(shù)同時(shí)增加對細(xì)胞免疫和體液免疫均有促進(jìn)作用，即表明機(jī)體免疫功能增強(qiáng)［11］。脾細(xì)胞抗體溶血素水平是反映體液免疫的一項(xiàng)常用指標(biāo)，其發(fā)生機(jī)制如下:綿羊紅細(xì)胞作為一種較強(qiáng)的抗原性異物，注入小鼠腹腔后其淋巴細(xì)胞便產(chǎn)生相應(yīng)的抗體溶血素，并釋放至外周血;取小鼠血清與綿羊紅細(xì)胞一起溫育，并在補(bǔ)體參與下可以產(chǎn)生溶血現(xiàn)象;測其上清液的OD值可間接判斷血清中抗體形成的數(shù)量，OD值越大，則表明抗體產(chǎn)生量越多［12］。顧笑梅等［13］報(bào)道，LAB 發(fā)酵液提取的EPS可明顯增強(qiáng)荷瘤小鼠的免疫功能。本研究顯示，Lb.組、St.組及混合組的足墊厚度差值、脾臟質(zhì)量、脾臟指數(shù)、抗體溶血素水平均顯著高于對照組，其中混合組抗體溶血素水平升高尤為明顯。提示保加利亞乳桿菌發(fā)酵液、嗜熱鏈球菌發(fā)酵液及其混合液均能顯著改善小鼠的細(xì)胞免疫和體液免疫功能?？赡軝C(jī)制為兩種發(fā)酵液具有下列特點(diǎn):①含有EPS、γ-氨基丁酸等多種免疫調(diào)節(jié)成分，可刺激B細(xì)胞分化增殖轉(zhuǎn)變?yōu)闈{細(xì)胞，促進(jìn)特異性抗體的產(chǎn)生;可通過刺激效應(yīng)T細(xì)胞的分化、增殖增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能，因T細(xì)胞有表面分化抗原CD3+、CD4+、CD8+多個(gè)亞群，需進(jìn)一步明確CD4+/CD8+以明確其免疫力提高的機(jī)制。②混合發(fā)酵液中免疫調(diào)節(jié)成分更為全面，能彌補(bǔ)單一菌種分解不同糖類的不足，將不同菌種依最適組合、比例調(diào)配制成復(fù)合的發(fā)酵劑菌種有望提高產(chǎn)品的質(zhì)量和效果［1］。

綜上所述，保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌發(fā)酵液對胃癌細(xì)胞增殖的直接抑制效果不明顯，但對小鼠的細(xì)胞免疫與體液免疫均具有增強(qiáng)作用;此研究有望為腫瘤防治提供新思路。

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