烏梅丸對TNBS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎大鼠脾臟組織β-arrestin1表達(dá)的影響

柯琴梅，吳 霽，范 恒

(1 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院，武漢 430022;2 南昌大學(xué)第三附屬醫(yī)院)

目前認(rèn)為，免疫等因素在結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。正常情況下，機(jī)體一方面通過誘導(dǎo)T細(xì)胞活化增殖去除抗原，另一方面通過T細(xì)胞凋亡而抑制T細(xì)胞過度產(chǎn)生和活化，從而使腸黏膜內(nèi)免疫系統(tǒng)處于一種適合機(jī)體生存的平衡狀態(tài)。若T細(xì)胞凋亡受抑，體內(nèi)T細(xì)胞將過度活化與增殖，并分泌炎性因子［1］，導(dǎo)致腸道炎癥發(fā)生。研究表明，烏梅丸治療潰瘍性結(jié)腸炎有顯著療效［2，3］。范恒等［4，5］研究表明，烏梅丸可下調(diào)結(jié)腸組織 β2AR、βarrestin2、NF-κB p65 的表達(dá)，減少腸道炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10 釋放，減輕腸道炎癥損傷。2010年9月～2011年9月，我們觀察了烏梅丸對2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠脾臟組織β-arrestin1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響，旨在研究烏梅丸治療結(jié)腸炎的免疫機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 56只清潔級健康雄性(SD)大鼠56只，體質(zhì)量200～250 g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動物中心提供，均在濕度為50% ～70%、溫度為20℃的動物房內(nèi)飼養(yǎng)。隨機(jī)分成空白對照組、模型組、美沙拉嗪組、烏梅丸組各14只。

1.2 實驗試劑 5%TNBS購于美國Sigma公司。Trizol購于Invitrogen公司;RNA提取試劑盒DP430，cDNA第一鏈合成試劑盒KR104-02，RNase抑制劑DP418購于天根;引物合成于金斯瑞;SYBR Green PCR Master Mix(2X)#K0242，實時熒光定量PCR儀ABI7500，引物由 Primer6.0軟件設(shè)計。RIPA裂解液(強(qiáng))、BCA蛋白濃度測定試劑盒，聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，相關(guān)一抗、二抗，ECL底物液;電泳槽、電轉(zhuǎn)儀Millipore。烏梅丸，按傳統(tǒng)方法配制成含生藥質(zhì)量濃度分別為0.515 g/L的水煎劑;將88片美沙拉嗪(0.5 g/片)用研缽研細(xì)，100目篩過篩，研磨，配成50 kg/L混懸液。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型制備及干預(yù) 除空白對照組外，其他組大鼠均在禁食、不禁飲24 h后給予TNBS灌腸。具體方法:用10%的水合氯醛以3 mL/kg腹腔注射麻醉，將導(dǎo)尿管緩緩插入大鼠肛門8 cm，先后緩慢注入50%乙醇溶液0.25 mL、5%的 TNBS溶液0.3 mL，將大鼠提尾倒置30 s，待清醒后自由飲食、進(jìn)水。模型建成后，觀察各組大鼠精神狀態(tài)、大便顏色及形狀、皮毛等變化。2 d后，美沙拉嗪組每天予美沙拉嗪混懸液3 mL灌胃，烏梅丸組每天用等量烏梅丸藥液灌胃，空白對照組和模型組每天用等量蒸餾水灌胃，連續(xù)15 d。每組大鼠死亡4只，因此每組實驗大鼠最后各剩10只。第16天每只大鼠禁食、不禁水24 h后處死，取大鼠脾臟，并各分為2份，裝于EP管中，用液氮冰凍保存。

1.3.2 β-arrestin1 mRNA表達(dá)檢測 采用 RT-PCR法。按RNA提取試劑盒DP430的方法提取脾臟組織RNA，用分光光度計測量濃度，取5 μL模板RNA、Oligo(dT)15(10 μmol/L)2 μL、ddH2O(Rnase free)6 μL混勻后放入PCR儀中，70℃ 5 min，立即置于冰上1 min，瞬時離心并加入以下試劑:5×RT buffer 4 μL、HRP(RRI)/RNase Inhibitor 0.5 μL、M-MLV 0.5 μL、dNTP(2.5 mmol/L)2 μL，總體積為 20 μL的反應(yīng)體系。逆轉(zhuǎn)錄條件:42℃ 30 min，99℃5 min，4 ℃ 5 min。 β-arrestin1 引 物:5'-CT CAAGCATGAGGACACGAA-3'，5'-TTAGGCTTGGGGT GCATTAG-3'。擴(kuò)增條件:95℃ 60 s預(yù)變性，進(jìn)入PCR 循環(huán)95℃ 15 s，58℃ 15 s，72℃ 45 s，40個循環(huán)，以β-actin為內(nèi)參，對β-arrestin1的產(chǎn)物相對定量，讀取CT值，使用2-ΔΔCT方法進(jìn)行相對定量分析。

1.3.3 β-arrestin1蛋白表達(dá)檢測 采用 Western blot法。取250～500 mg脾臟組織，剪碎加1 mL RIPA裂解液(強(qiáng))，勻漿抽提總蛋白，并按BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒說明操作，測定蛋白濃度。取70 μg總蛋白上樣電泳，用12%的PAGE凝膠電泳。取出凝膠根據(jù)Marker切下目的條帶，用蒸餾水沖洗，剪與PAGE凝膠相同大小的PVDF膜和濾紙，PVDF膜用甲醇浸泡數(shù)秒后和濾紙一同浸泡于電轉(zhuǎn)緩沖液中。轉(zhuǎn)膜條件:200 mA，120 min。用含5%脫脂奶粉的TBST(封閉液)浸泡PVDF膜，室溫?fù)u床封閉2 h。一抗:用封閉液1∶700 稀釋 β-arrestin1、1∶1000 稀釋GAPDH相應(yīng)的一抗。使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4℃孵育過夜。TBST充分洗滌PVDF膜5～6次，每次5 min，封閉液1∶10000稀釋羊抗兔二抗，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，室溫?fù)u床孵育2 h。顯色曝光:TBST充分洗滌PVDF膜5～6次。結(jié)果采用光密度掃描灰度值分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸組織病理改變 模型組固有層和黏膜層內(nèi)可見彌漫性中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤，結(jié)腸黏膜腺體排列紊亂，杯狀細(xì)胞減少?？瞻讓φ战M黏膜和固有層結(jié)構(gòu)完整，腺體排列較整齊。烏梅丸組和美沙拉嗪組淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤較模型組減輕，黏膜及固有層結(jié)構(gòu)相對完整，杯狀細(xì)胞較模型組多，腺體排列相對整齊。

2.2 脾臟組織β-arrestin1 mRNA、蛋白的表達(dá) 見表1。

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎是一種慢性非特異性腸道炎癥性疾病，其病因和發(fā)病機(jī)制仍不清楚。目前，大多數(shù)研究認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制主要由免疫反應(yīng)介導(dǎo)，是與遺傳、感染、環(huán)境因素等密切相關(guān)的慢性炎性疾病，且細(xì)胞因子在潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病中起著重要的作用。βarrestin1在機(jī)體廣泛表達(dá)，可存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，作為腳手架蛋白與連接分子(比如磷脂類和β-銜接蛋白)連接參與多種信號通路，在抗凋亡通路中起重要作用。廖奕等［6］研究表明，氧化苦參堿可下調(diào)結(jié)腸組織 β-arrestin1表達(dá)，抑制 δ阿片受體(DOR)-β-arrestin1-Bcl-2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，治療TNBS誘導(dǎo)的實驗性大鼠結(jié)腸炎。

表1 四組脾臟組織β-arrestin1 mRNA、蛋白的表達(dá)比較()

表1 四組脾臟組織β-arrestin1 mRNA、蛋白的表達(dá)比較()

注:與空白對照組比較，△P ＜0.05;與模型組比較，#P ＜0.05

組別 β-arrestin1 mRNA β-arrestin1蛋白烏梅丸組 1.54 ±0.14# 0.74 ±0.19#美沙拉嗪組 1.63 ±0.27# 0.77 ±0.15#模型組 3.27±0.41△ 1.50±0.15△空白對照組1.05 ±0.06 0.62 ±0.07

烏梅丸由烏梅、細(xì)辛、干姜、黃連、當(dāng)歸、附子、蜀椒、桂枝、黨參、黃柏組成。烏梅丸出自仲景《傷寒論·厥陰病篇》，方中以烏梅酸斂收固，附子、干姜、桂枝扶陽以勝寒，蜀椒、細(xì)辛通陽以破陰，附子、干姜、蜀椒、桂枝、細(xì)辛，辛熱以助其陽，溫以祛寒;黃連、黃柏之苦寒以堅其陰，清以瀉熱，黨參、當(dāng)歸益氣養(yǎng)血，諸藥合用，使寒熱邪去，陰陽協(xié)調(diào)，氣血恢復(fù)。全方酸收熄風(fēng)，辛熱助陽，酸苦堅陰，寒熱溫涼，溫清斂補(bǔ)，攻補(bǔ)兼施，諸藥配伍，調(diào)理陰陽寒熱虛實，使之歸復(fù)于平和。本研究發(fā)現(xiàn)，烏梅丸組與美沙拉嗪組均較模型組結(jié)腸黏膜及固有層結(jié)構(gòu)相對完整，腺體排列相對整齊，杯狀細(xì)胞多，炎性細(xì)胞浸潤較模型組減輕，表明烏梅丸與美沙拉嗪對潰瘍性結(jié)腸炎有較好的治療作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，模型組β-arrestin1 mRNA、蛋白表達(dá)較空白對照組升高，烏梅丸組及美沙拉嗪組β-arrestin1 mRNA、蛋白表達(dá)較模型組降低。提示烏梅丸可通過下調(diào)β-arrestin1表達(dá)發(fā)揮治療結(jié)腸炎的作用?？赡軝C(jī)制:①通過DOR-β-arrestin1-Bcl-2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑介導(dǎo)T細(xì)胞的抗凋亡作用。研究表明，T細(xì)胞的TCR/CD28共刺激信號被激活后，使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)β-arrestin募集至TCR上，使cAMP水平降低，下調(diào)cAMP-PKA-Csk抑制性信號，完全活化T細(xì)胞，繼而激活 TrkA/IP3/Akt/NF-κB信號通路，誘導(dǎo)T細(xì)胞表達(dá)DOR［7］?；罨?DOR信號能誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)β-arrestin1轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)的β-arrestin1募集組蛋白乙?；竝300至Bcl-2啟動子位點結(jié)合，使Bcl-2的啟動子序列區(qū)域組蛋白H4乙?；饔迷鰪?qiáng)，導(dǎo)致Bcl-2基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)［8］，從而抑制T細(xì)胞凋亡。②此外，β-arrestin1還可通過磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt信號通路介導(dǎo)抗凋亡作用［2］。烏梅丸可下調(diào)脾臟組織β-arrestin1的mRNA和蛋白表達(dá)，繼而通過多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［9］促進(jìn)脾臟組織T細(xì)胞的凋亡、減少T細(xì)胞分泌炎癥因子，從而減輕結(jié)腸黏膜的炎癥反應(yīng)。因此，以CD4+T細(xì)胞為靶向，研制相關(guān)的單克隆抗體或者其他藥物降低CD4+T的數(shù)目和反應(yīng)性，可望為治療結(jié)腸炎提供更好的方法。

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