合成生物系統(tǒng)的組合優(yōu)化

顧群，李一凡，陳濤

1天津大學(xué)化工學(xué)院生物工程系，天津 300072

2教育部系統(tǒng)生物工程重點實驗室，天津 300072

合成生物學(xué)旨在工程學(xué)思想的指導(dǎo)下，從頭設(shè)計并構(gòu)建新的生物元件、模塊和系統(tǒng)，或?qū)ΜF(xiàn)有的、天然的生物系統(tǒng)進行重新設(shè)計和改造[1]。利用合成生物學(xué)的工程思路，人們不僅建立了模擬物理學(xué)的基因電路，包括雙穩(wěn)態(tài)開關(guān)、振蕩器、邏輯門等，還希望通過重新構(gòu)建生物代謝網(wǎng)絡(luò)，解決生物化工、生物能源、生物材料、生物醫(yī)藥領(lǐng)域以及關(guān)系國計民生的大問題[2]。

對生物元件和系統(tǒng)進行完全理性設(shè)計，實現(xiàn)生物系統(tǒng)的標準化一直是合成生物學(xué)家多年追求的目標[1,3]。代謝工程最早也致力于利用系統(tǒng)已知計量關(guān)系、動力學(xué)方程及相關(guān)知識對細胞表型進行理性修飾[4]。隨著系統(tǒng)生物學(xué)和各種組學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，人們對生物擾動效果的預(yù)測能力及對生物系統(tǒng)理性設(shè)計的能力都逐漸增強[5]。然而，越來越多的研究也表明，由于生物系統(tǒng)的高度復(fù)雜性和非線性的特點，基因線路的完全理性設(shè)計通常無法實現(xiàn)功能最優(yōu)化。于是，一種“半理性”的工程方法——組合工程方法應(yīng)運而生[6]。

組合優(yōu)化的工程思路包括以下3個元素：1)通過特定的技術(shù)手段構(gòu)建優(yōu)化對象 (基因線路，代謝網(wǎng)絡(luò)或細胞)的文庫。2)在文庫中篩選獲得功能優(yōu)化的對象。3)檢測并分析賦予對象優(yōu)化功能的要素[6]。組合優(yōu)化的技術(shù)思路與生產(chǎn)菌株的進化相似，但其與傳統(tǒng)進化方法相比仍有很大不同。傳統(tǒng)進化更偏向于在基因組范圍內(nèi)進行隨機突變，而組合優(yōu)化通常是對系統(tǒng)功能有影響的關(guān)鍵元素進行集中突變或修飾來獲取最優(yōu)表型。這種集中突變的思路既可以更快速高效地獲得豐富的基因型或表型，又能同時避免不相關(guān)區(qū)域的不利突變。換言之，組合優(yōu)化是介于進化和理性設(shè)計之間的優(yōu)化策略，是一種對進化的理性設(shè)計。本文介紹了組合優(yōu)化方法的工程策略和技術(shù)原理，聚焦于設(shè)計構(gòu)建文庫多樣性的方法，并總結(jié)和評述了組合工程方法在工程中的應(yīng)用及進展 (表 1)。

1 單個元件的微調(diào)

生物元件是構(gòu)成合成基因線路的基本元素[1]，因此生物元件的特性和功能直接影響到合成基因線路的功能。一個新合成的基因線路通常需要對其組成元件進行微調(diào)，以使線路發(fā)揮出最理想的效果。合成基因線路的元件包括復(fù)制起始位點、啟動子、RBS序列、基因間序列、終止子、功能蛋白等等[7]，通過對上述各單個元件的微調(diào)可以改善基因線路的性能。

1.1 優(yōu)化質(zhì)粒的拷貝數(shù)

現(xiàn)今絕大多數(shù)功能線路和代謝通路都是在質(zhì)粒上構(gòu)建，而質(zhì)粒拷貝數(shù)對基因線路的功能會產(chǎn)生一定影響。高拷貝質(zhì)粒使功能蛋白基因獲得高水平表達的同時，卻給細胞帶來較大的生理負擔。此外，代謝通路中特定酶的高水平表達會對細胞產(chǎn)生毒性物質(zhì)，阻礙細胞行使某些必需功能。Jones等發(fā)現(xiàn)，將表達DXP合酶的基因從高拷貝數(shù)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到低拷貝數(shù)的質(zhì)粒上，番茄紅素的產(chǎn)量可以提高2～3倍[8]。然而如今代謝工程和合成生物學(xué)中可供選擇的質(zhì)粒仍然比較有限，且一些質(zhì)粒之間具有不相容性 (比如pSC101和p15A)，因此通過改變質(zhì)粒拷貝數(shù)還無法實現(xiàn)功能元件表達強度的連續(xù)性微調(diào)。

表1 合成生物系統(tǒng)的組合優(yōu)化方法的研究進展Table 1 Summary of research on combinatorial optimization of synthetic biological systems

1.2 合成啟動子文庫

啟動子是結(jié)構(gòu)基因上游起始轉(zhuǎn)錄的一段序列，它的強度決定了結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄強度，因此啟動子成為優(yōu)化基因線路功能的一個重要對象。Alper等最先使用構(gòu)建啟動子文庫的方法來優(yōu)化代謝通路[9]。他們首先用易錯PCR法在高性能天然啟動子中引入點突變，隨機引入的點突變使文庫中的啟動子具有不同的強度，由此構(gòu)建了大腸桿菌PLteto-1啟動子文庫和釀酒酵母TEF啟動子文庫。之后，作者利用獲得的文庫優(yōu)化了dxs基因的表達強度，以提高番茄紅素的產(chǎn)量。研究發(fā)現(xiàn)，啟動子強度最大時，菌株生產(chǎn)番茄紅素的產(chǎn)量并非最高，最高產(chǎn)番茄紅素菌株的代謝通路上啟動子的強度僅為中等，這一現(xiàn)象說明基因表達強度過高并不能使菌株獲得相對優(yōu)化的產(chǎn)量。Ellis等通過設(shè)計簡并引物，構(gòu)建了具有不同表達強度和抑制強度的誘導(dǎo)型啟動子文庫，這種方法成功應(yīng)用于前饋環(huán)和計時器的微調(diào)，最終實現(xiàn)了對酵母沉降時間的控制[10]。此方法并不完全局限于進行非理性微調(diào)，而是將非理性的優(yōu)化與理性的模型預(yù)測進行結(jié)合，從而降低了優(yōu)化代謝通路的時間和成本。如今，啟動子文庫在很多宿主細胞中都能被構(gòu)建出來，它們能用于優(yōu)化很多生物系統(tǒng)的功能。

1.3 基于RBS位點的調(diào)控工具

RBS位點是調(diào)節(jié)翻譯強度的重要元件。Salis等結(jié)合熱力學(xué)模型開發(fā)了RBS計算器 (RBS calculator)，可以理性設(shè)計所需強度的核糖體結(jié)合位點序列[11]。有趣的是，作者發(fā)現(xiàn)RBS序列的強度并不是一定的，而會受其所表達基因序列的影響，同樣的RBS表達不同的基因序列，其表達強度的差異可達10倍之多，這為理性設(shè)計帶來了額外的困難，因此有必要通過組合的方法對生物元件進行微調(diào)。RBS計算器另一個重要功能是設(shè)計RBS的簡并序列，生成一個表達強度在所需范圍內(nèi)變化的序列文庫。因為RBS序列很短，人工設(shè)計的RBS文庫可以很方便地通過引物設(shè)計和PCR擴增來實現(xiàn)與特定基因的連接，從而對基因表達強度進行微調(diào)。

Egbert等開發(fā)了一種利用RBS序列中“簡單重復(fù)序列”(Simple sequence repeats)(SSR)來調(diào)節(jié)基因表達強度的方法[12]。這種方法有3個優(yōu)點：一是重復(fù)序列的長度與RBS序列的強度具有相關(guān)性，這使得該法具有表達強度的可預(yù)測性；二是SSR對基因表達強度的調(diào)節(jié)范圍非常廣，它們可使基因表達強度最多相差1 000倍；三是這種重復(fù)序列不穩(wěn)定，可以通過PCR法或者組合組裝法來對其進行快速突變。為了證明這個方法的實用性，作者用SSR微調(diào)了一個雙穩(wěn)態(tài)開關(guān)系統(tǒng)中兩個抑制蛋白的表達強度。值得一提的是，作者發(fā)現(xiàn)雙穩(wěn)態(tài)開關(guān)系統(tǒng)的功能具有菌株特異性，同樣的開關(guān)，在實驗菌株中表現(xiàn)良好，而放到另外一株工業(yè)菌中可能會喪失其功能。

1.4 優(yōu)化可調(diào)控基因間序列 (TIGRs)

基因間序列的改變也會對基因表達強度產(chǎn)生重大影響。Pfleger等通過可調(diào)控基因間序列(Tunable intergenic regions，TIGRs)，實現(xiàn)了在一個操縱子內(nèi)，對多個基因表達強度的同時調(diào)節(jié)[13]。TIGRs由多種控制元件組成，它們包括：mRNA二級結(jié)構(gòu)、核糖核酸酶 (RNase)斷裂位點及RBS隔離序列，通過改變這些序列可以在轉(zhuǎn)錄后水平對基因的表達強度進行調(diào)節(jié)。作者利用TIGR法對三基因的甲羥戊酸生物合成途徑進行微調(diào)，將甲羥戊酸的產(chǎn)量提高了7倍。同時也發(fā)現(xiàn)當甲羥戊酸產(chǎn)量提高了7倍時，其中兩種基因——hmgs和tHMGR的活性是降低的。由此可見這些組合優(yōu)化策略的確能產(chǎn)生超出預(yù)期的有利突變體。

2 代謝通路的系統(tǒng)優(yōu)化

在合成生物系統(tǒng)的優(yōu)化過程中，只進行單個元件的調(diào)節(jié)往往難以實現(xiàn)系統(tǒng)功能的最優(yōu)化。生物系統(tǒng)的各個部分之間是緊密聯(lián)系并且互相協(xié)調(diào)的，單一元件的過度擾動經(jīng)常會影響其他元件的功能調(diào)節(jié)，從而導(dǎo)致代謝失衡。大量代謝控制分析方面的研究表明：許多代謝通路的主要通量控制步驟往往分布在多個反應(yīng)中，代謝通路的優(yōu)化需要同時對這些反應(yīng)進行微調(diào)以保持代謝平衡。否則，代謝失衡將導(dǎo)致細胞內(nèi)某些中間代謝物濃度過度波動，從而對細胞的生長或性能造成損害。同時，過度表達的基因也會給細胞帶來沉重的代謝負擔。另外，不同元件對系統(tǒng)功能的調(diào)節(jié)作用有時會有協(xié)同效應(yīng)，對單個元件的擾動往往只能對系統(tǒng)功能產(chǎn)生微小的影響，而對多個元件的同時修飾能更好地優(yōu)化系統(tǒng)的功能。由此可見，合成系統(tǒng)中各個部分的組合優(yōu)化對獲得最優(yōu)化功能是極為重要的。

2.1 多元模塊工程

多元模塊工程 (Multiple module engineering)是一種能進行代謝通路組合優(yōu)化的有效策略[14-15]。其工程思路是將整個代謝通路分成不同的模塊，再通過系統(tǒng)地改變各個模塊的復(fù)制起始位點，啟動子或者RBS序列來協(xié)調(diào)不同模塊的表達強度(圖1A)。利用多元模塊工程策略，只需組合構(gòu)建少數(shù)的模塊組合，就可以在大范圍內(nèi)優(yōu)化代謝通路。

多元模塊工程已成功運用于生物產(chǎn)品產(chǎn)量的工程優(yōu)化，其最成功的例子是Ajikumar等對紫杉二烯代謝通路的優(yōu)化[14]。作者將整個通路分成兩個部分：一為包含內(nèi)源的MEP通路合成異戊烯焦磷酸的上游模塊；二為包含外源的萜類化合物合成途徑的下游模塊。之后用不同強度的啟動子和不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒與兩個模塊組合，或?qū)⒉煌瑥姸鹊膯幼优c某個模塊組合后整合到基因組上再進行表達。作者共構(gòu)建了32種不同組合的菌株，并從中成功分離了高產(chǎn)紫杉二烯的菌株，其最高產(chǎn)量能達到1 g/L，是對照菌株的15 000倍。更為有趣的是，作者發(fā)現(xiàn)最高產(chǎn)量菌株的上游模塊是整合到基因組上的，表達強度很弱，而這恰好平衡了兩個模塊的代謝通量，降低了胞內(nèi)吲哚的積累，從而解除了吲哚對細胞生長的抑制。

利用相似工程思路，Xu等將脂肪酸代謝通路分成3個模塊：上游的乙酰輔酶A合成模塊、中游的乙酰輔酶A激活模塊和下游的脂肪酸合成模塊。作者通過改變這3個模塊的拷貝數(shù)，使乙酰輔酶A的合成和丙二酰輔酶A的消耗達到平衡，實現(xiàn)了對多個模塊表達強度的組合優(yōu)化。為了進一步提高產(chǎn)量，作者又將上游模塊和下游模塊基因的RBS位點進行組合微調(diào)，進一步將產(chǎn)量提高了46%[16]。

2.2 基于基因合成技術(shù)的組合優(yōu)化工具

多元模塊工程也有其內(nèi)在的缺點，它通常使用傳統(tǒng)的酶切連接技術(shù)，構(gòu)建非常有限的模塊組合 (不超過100)，而難以進行高通量的系統(tǒng)優(yōu)化。近幾年基因合成技術(shù)取得了突飛猛進的發(fā)展，許多基于重疊延伸技術(shù)和同源重組技術(shù)的多片段組裝技術(shù)如雨后春筍般涌現(xiàn)出來[17-23]。相比傳統(tǒng)的酶切連接克隆技術(shù)，這些多片段組裝技術(shù)通常具以下3個優(yōu)點：一是它們對克隆序列的依賴性較低，不需要酶切位點的輔助；二是能夠?qū)崿F(xiàn)多個片段的同時組裝；三是其中某些技術(shù)具有高效克隆多片段的能力，能用來生成比較大的文庫，因此具有對代謝通路中多個元件進行組合優(yōu)化的能力[22]。

Shao等基于其實驗室早前開發(fā)的“DNA組裝器 (DNA assembler)[19]”技術(shù)，又開發(fā)了一種名為“組合轉(zhuǎn)錄工程優(yōu)化法 (COMPACTER)”的技術(shù)，此技術(shù)通過將不同強度的啟動子與不同代謝通路的基因進行組合，之后再運用高通量的篩選方法來構(gòu)建篩選出最高效的代謝通路，由此實現(xiàn)對代謝通路中多個基因表達強度的組合優(yōu)化(圖1B)，該技術(shù)已成為將組裝技術(shù)成功應(yīng)用于代謝通路組合優(yōu)化的經(jīng)典案例[24]。利用此法，Du等優(yōu)化了酵母細胞中木糖和纖維二糖的利用途徑，僅通過一輪的COMPACTER就獲得了當時文獻報道的最高效的利用途徑。這些優(yōu)化的木糖和纖維二糖利用途徑具有菌株特異性，即從實驗室菌株和工業(yè)菌株出發(fā)，各自優(yōu)化得到的最優(yōu)代謝通路是不同的，而且同一個代謝通路在實驗室菌株和工業(yè)菌株中會有截然不同的表現(xiàn)。該技術(shù)可以做到量體裁衣，為不同背景的菌株“定制”其特有的最優(yōu)代謝通路。

Gibson組裝技術(shù)[23]也可以對基因線路進行組合組裝。JCVI實驗室的Ramon等利用Gibson組裝將3個啟動子 (recA，ssb，lacI)和4個物種中的乙酸代謝通路 (ackA，pta)進行了隨機的組合組裝，一個反應(yīng)就能得到104的文庫。作者用菌落PCR法檢測了37個克隆后發(fā)現(xiàn)，其中81%含有正確長度的序列，然而遺憾的是作者并沒有對文庫的質(zhì)量和多樣性做進一步的研究[25]。

圖1 系統(tǒng)優(yōu)化代謝通路的組合工程工具 (A:多元模塊工程；B:組合轉(zhuǎn)錄工程優(yōu)化法；C:迭代重組法)Fig.1 Combinatorial engineering tools for systematically optimization of metabolic pathways.(A)Multiple module engineering.(B)COMPACTER technology.(C)Reiterative recombination.

Quan等開發(fā)了一種名為環(huán)形聚合酶延伸法(Circular polymerase extension cloning，CPEC) 的技術(shù)，此技術(shù)能將末端重疊的多個片段和載體一步連接成完整的環(huán)狀質(zhì)粒，然后得到的質(zhì)粒可直接轉(zhuǎn)化入細胞以進行篩選克隆[26]。作者將含1.7 kb的HIV病毒包膜基因gp120分成等長的兩個片段，每個片段都含有密碼子變體。通過CPEC方法將兩個片段和質(zhì)粒骨架進行組裝得到反應(yīng)產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化1 pmol反應(yīng)產(chǎn)物可以獲得2.436×105的克隆，從而證實了其組合組裝的強大能力。

另一個特別的構(gòu)建多基因代謝通路文庫的方法是Cornish實驗室開發(fā)的“迭代重組法(Reiterative recombination)”[27]，迭代重組法可以用于構(gòu)建大于104的代謝通路文庫。此方法利用酵母的同源重組系統(tǒng)及幾種循環(huán)使用篩選標記，可以迭代地在酵母基因組中構(gòu)建多基因代謝通路 (圖1C)。作者用這個技術(shù)構(gòu)建了crtE、crtB、crtI的三基因的番茄紅素代謝通路。

2.3 多元質(zhì)粒工程

本實驗室結(jié)合之前提到的RBS計算器設(shè)計出一系列ssDNA，基于ssDNA重組技術(shù)構(gòu)建了多元質(zhì)粒工程 (MIPE)。MIPE技術(shù)可以同時高效地修改質(zhì)粒上多個位點。作者利用MIPE技術(shù)對核黃素代謝通路的5個基因的表達強度進行了組合優(yōu)化，僅在1周內(nèi)就獲得了核黃素產(chǎn)量提高2.6倍的克隆。

3 基因組范圍內(nèi)靶點的識別和組合修飾

全局調(diào)控因子和一些看似不相關(guān)基因的改變都會對生物系統(tǒng)的功能產(chǎn)生影響，從而造就系統(tǒng)的復(fù)雜性。因此，為了獲得最優(yōu)的生物學(xué)功能，通常需要在全基因組范圍內(nèi)尋找基因靶點，再對其進行組合優(yōu)化。

3.1 基因組范圍內(nèi)靶點的識別

轉(zhuǎn)座子隨機突變是在全基因組范圍內(nèi)搜索目標靶點的有效方法，盡管早前插入序列更傾向于插入某些熱點區(qū)域，但如今系統(tǒng)經(jīng)過優(yōu)化后，插入序列已能高效均勻地插入到整個基因組中。一些能進行基因組基因隨機強表達的技術(shù)可以與轉(zhuǎn)座子隨機敲除技術(shù)互補，Jin等將大腸桿菌基因組切割并隨機連入到質(zhì)粒中進行表達，以此來篩選番茄紅素高產(chǎn)菌株，最后作者成功發(fā)現(xiàn)了對番茄紅素的產(chǎn)量有不同程度提高的16個不同位點[28]。

3.2 全轉(zhuǎn)錄工程 (gTME)

全轉(zhuǎn)錄工程 (Global transcription machinery engineering，gTME)是一種重構(gòu)轉(zhuǎn)錄組的新方法[29]。它通過對菌株的全局轉(zhuǎn)錄因子進行突變，以在全局范圍內(nèi)調(diào)節(jié)基因的表達強度 (圖2A)。Alper等通過在大腸桿菌σ因子中引入突變，篩選到一系列最優(yōu)表型菌株，如具有乙醇、十二烷基鈉耐受性且能高產(chǎn)番茄紅素的菌株。利用類似方法，對釀酒酵母的TATA盒結(jié)合蛋白進行突變，分離了一株具有高度葡萄糖/乙醇耐受性的菌株，其乙醇的體積生產(chǎn)力提高了70%[30]。

3.3 可追蹤多元重組工程 (TRMR)與多元自動化基因組工程 (MAGE)

合成生物學(xué)的飛速發(fā)展催生了一些更加強大的技術(shù)，這些技術(shù)可以高通量且快速地搜索或修改基因組。Warner等開發(fā)了可追蹤多元重組工程 (Trackable multiplex recombineering，TRMR)，能同時對基因組上千個位點進行分析和修飾[31](圖2B)。作者利用TRMR技術(shù)成功獲得了不同抑制劑存在下大腸桿菌的生長圖譜。經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)，一些基因的敲除和強表達都可以使大腸桿菌對不同抑制劑產(chǎn)生耐受性。利用此技術(shù)，作者還得到了使細胞耐受纖維素水解液的基因修飾，這一研究成果對工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域有著重要的意義。TRMR技術(shù)最大的優(yōu)勢是可以在非常短的時間內(nèi)，只需消耗較低成本就可以獲得上千個基因敲除和強表達的細菌，之后輔助微陣列技術(shù)就能對這些文庫進行簡單快速的追蹤，使基因功能研究的通量提高了幾個數(shù)量級。然而在單輪操作中，利用TRMR技術(shù)通常只能對單個細胞產(chǎn)生單個基因修飾，因此現(xiàn)今TRMR技術(shù)難以用于研究那些需要兩個或多個位點同時修飾才能獲得的特定細胞表型。

多元自動化基因組工程 (Multiplex automated genome engineering，MAGE)作為另一種強大的高通量修改基因組的工具，能同時瞄準并改造單個細胞基因組上的多個靶點，從而在一個細胞群體中形成組合的基因組多樣性[32](圖2C)。這種多元化方法是一種基于進化的理性設(shè)計法，與傳統(tǒng)進化方法相比，此法能使進化更加理性快速地進行。作者又利用MAGE技術(shù)循環(huán)性和可升級性 (Scalable)的特點，專門為此技術(shù)建造了一個自動化機器，進一步實現(xiàn)了多元基因組工程的自動化，此機器能用來快速連續(xù)地產(chǎn)生不同基因突變的集合。為了檢驗MAGE技術(shù)的實用性，作者試圖對番茄紅素生產(chǎn)途徑上的24個基因進行同時優(yōu)化。一天內(nèi)，借助自動化機器可以產(chǎn)生數(shù)十億個不同基因型的突變株，經(jīng)過3 d的進化，就能從中挑選到番茄紅素生產(chǎn)能力提高5倍的菌株。之后該作者還利用MAGE技術(shù)，成功地將大腸桿菌中314個TAG終止密碼子定點修改成TAA，由此獲得一株不含有TAG終止密碼子的菌株[33]。

TRMR技術(shù)和MAGE技術(shù)一經(jīng)出現(xiàn)就在相關(guān)領(lǐng)域掀起軒然大波，研究者很快發(fā)現(xiàn)這兩個技術(shù)具有互補性，若能將其有效結(jié)合將會產(chǎn)生一個更強大的研究策略，即先利用TRMR技術(shù)在全基因組范圍內(nèi)尋找基因靶點，再用MAGE技術(shù)對發(fā)現(xiàn)的基因的表達強度組合微調(diào)，Sandoval等很快就進行了這種嘗試[34]。他們首先利用TRMR技術(shù)去尋找細胞耐受乙酸纖維素裂解液和弱堿環(huán)境的基因，發(fā)現(xiàn)有27個基因的表達會對菌株的耐受性產(chǎn)生較大影響。之后又通過MAGE技術(shù)來修改這27個基因的RBS位點，以實現(xiàn)對其表達強度的組合微調(diào)，最終獲得了比野生型菌株生長快10%～200%的一系列菌株。

3.4 基于RNA的組合修飾工具

不同于上述基于DNA修飾的技術(shù)，Na等又開發(fā)了一種利用小型調(diào)控RNA對大腸桿菌進行代謝工程操作的技術(shù)[35]。它通過表達的sRNA與靶向基因轉(zhuǎn)錄翻譯區(qū)域的結(jié)合，來實現(xiàn)對翻譯過程的阻遏作用，進而下調(diào)相關(guān)基因的表達。此技術(shù)的優(yōu)勢在于：在不修改基因組的情況下，此技術(shù)也能調(diào)節(jié)基因的表達強度，而且通過將sRNA與DNA結(jié)合區(qū)域結(jié)合，它能實現(xiàn)對基因表達強度的微調(diào)。利用這個技術(shù)，作者對酪氨酸生物合成途徑進行了優(yōu)化，他們針對14株不同菌株內(nèi)的4個基因進行了表達強度的組合下調(diào)，并最終獲得了可以生產(chǎn)2 g/L酪氨酸的菌株。之后，作者又合成了與戊二胺生物合成相關(guān)的基因?qū)?yīng)的130種sRNA，其中發(fā)現(xiàn)murE的弱表達可以使戊二胺產(chǎn)量提高55%。

4 結(jié)論與展望

生物系統(tǒng)組合優(yōu)化已經(jīng)成為合成生物學(xué)和代謝工程必要的組成部分?？傮w上講，生物系統(tǒng)組合優(yōu)化的策略有以下兩個發(fā)展方向：1)基因修飾和改造的方法會逐漸趨向于多元化，強調(diào)多位點的同時修改。2)基因靶點的選擇將越來越精確，文庫的設(shè)計與構(gòu)建工作也會越來越理性，從而減小對高通量篩選的需求。隨著基因合成和修飾技術(shù)的快速發(fā)展，將會有更高效的工程工具被開發(fā)出來。如近期出現(xiàn)的CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因組工程技術(shù)，迅速成為研究的熱點[36-38]。此技術(shù)不僅能進行細菌基因組的高效修飾[36]，還通過與RNAi技術(shù)相似的方法在不修改基因組的情況下調(diào)節(jié)基因的強度[39](圖2D)。雖然還沒有報道暗示這個技術(shù)能用于進行組合優(yōu)化，然而不可否認，此技術(shù)具有被開發(fā)成一種強大組合優(yōu)化工程工具的巨大潛力。筆者認為，利用傳統(tǒng)的單基因敲除法或強表達法來進行菌株優(yōu)化的時代已經(jīng)過去，研究者將會將更多的重點放在組合工程策略上，或選擇一種合適高效的組合工程技術(shù)，或是將不同技術(shù)相結(jié)合，以此來優(yōu)化目標性狀，最終為構(gòu)建生物的新功能提供更多有利條件。

圖2 基因組范圍內(nèi)進行組合修飾的組合工程工具及一個具有潛力的基因工程新技術(shù) (A：全轉(zhuǎn)錄工程；B：可追蹤多元重組工程；C：多元自動化基因組工程；D：CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因組工程技術(shù))Fig.2 Combinatorial engineering tools for introducing combinatorial genome wide modification and a new promising genetic engineering technology.(A)Global transcription machinery engineering(gTME).(B)Trackable multiplex recombineering(TRMR).(C)Multiplex automated genome engineering(MAGE).(D)CRISPR-Cas9 technology.

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