碎冰冷藏對(duì)羅非魚(yú)肌原纖維蛋白理化特性的影響

王 瑛，周春霞，洪鵬志，劉慧清

（廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東普通高等學(xué)校水產(chǎn)品深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江，524088）

我國(guó)是羅非魚(yú)的養(yǎng)殖大國(guó)，也羅非魚(yú)的消費(fèi)大國(guó)和貿(mào)易大國(guó)。2008年我國(guó)羅非魚(yú)出口量為22.4萬(wàn)t，占我國(guó)水產(chǎn)品貿(mào)易的第二位，2011年羅非魚(yú)的出口量高達(dá)33萬(wàn)[1]。由于其水分含量高，肌肉細(xì)嫩，死后很容易在微生物和酶的作用下發(fā)生變質(zhì)，且魚(yú)的收獲期相對(duì)集中，鮮活銷售量有限，捕獲后的產(chǎn)品如不采取適當(dāng)?shù)馁A藏措施會(huì)嚴(yán)重影響其市場(chǎng)流通和銷售。目前，水產(chǎn)品的保鮮方式主要有冷藏保鮮、冷海水保鮮、冰溫保鮮、微凍保鮮、冷凍保鮮和超冷快速保鮮。但是冷海水保鮮將魚(yú)體在冷海水中浸泡，魚(yú)體會(huì)因滲鹽吸水而膨脹，且魚(yú)肉略帶咸味，表面變色，魚(yú)肉蛋白容易損失，在以后的流通過(guò)程中容易提早腐爛；冰溫保鮮能利用的溫度區(qū)間很小，要求嚴(yán)格；微凍保鮮要求的溫度處于最大冰晶生成帶內(nèi)，容易引起蛋白質(zhì)變性；冷凍保鮮和超冷快速保鮮適用于羅非魚(yú)的長(zhǎng)期貯藏。冰藏保鮮是以冰為介質(zhì)，將魚(yú)體的溫度降低至接近冰的融點(diǎn)。由于冰容易得到，冷卻能力大，與魚(yú)體接觸無(wú)害，價(jià)格便宜，便于攜帶，因此長(zhǎng)期以來(lái)被用于水產(chǎn)品的保鮮[2]。但是雖然低溫能抑制酶的活性、微生物的生長(zhǎng)，但在保鮮過(guò)程中依然伴隨著糖原分解、脂肪氧化、蛋白質(zhì)變性等現(xiàn)象的發(fā)生[3]。分析現(xiàn)有水產(chǎn)加工品的構(gòu)成，冷凍和冷藏加工品仍是最重要的組成部分，占了一半以上，但是關(guān)于冰藏期間羅非魚(yú)肉肌原纖維蛋白理化特性的變化的研究很少。本文主要探討了碎冰冷藏法對(duì)羅非魚(yú)肉肌原纖維蛋白理化特性的影響，進(jìn)一步提高魚(yú)類貯藏的技術(shù)，以期望為羅非魚(yú)的貯藏、運(yùn)輸和銷售提供理論參考，同時(shí)為構(gòu)建羅非魚(yú)品質(zhì)評(píng)價(jià)體系提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅非魚(yú) 購(gòu)于湛江市湖光市場(chǎng)；ANS Sigma公司，色譜純；5’-ATPNa2上海源葉生物科技有限公司，分析純；乙二胺四乙酸、三羥甲基氨基甲烷、二硫代二硝基苯甲酸、米吐?tīng)柕?廣州化學(xué)試劑廠，分析純。

RF-5301P型熒光分光光度計(jì)、UV-2550型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；CR22GⅡ型高速速凍離心機(jī) 日本日立有限公司；FJ-200型高速分散均質(zhì)機(jī) 上海標(biāo)本模型廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的預(yù)處理 鮮活羅非魚(yú)每尾重約1kg，1h內(nèi)用冰保鮮運(yùn)回廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)品重點(diǎn)加工實(shí)驗(yàn)室后，除去內(nèi)臟和魚(yú)腮，清洗干凈后置于封口袋中，每3尾為一組，于封閉泡沫箱中加碎冰保存，下層冰厚約10cm，上層厚約5cm，每24h換冰一次，分別于冰藏第0、1、2、3、4、6、8、10、12、15d取樣測(cè)定。

1.2.2 pH的測(cè)定 按照GB/T 9695.5-2008肉與肉制品pH測(cè)定的方法進(jìn)行。取10g羅非魚(yú)肉置于100mL 0.1mol/L的 KCl溶液中，勻漿20s后，直接用pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定，待讀數(shù)穩(wěn)定后讀取數(shù)值。

1.2.3 肌原纖維蛋白溶液的制備 肌原纖維蛋白溶液的提取參考萬(wàn)建榮[4]的方法，并稍作修改：取200g碎魚(yú)肉樣品，添加4倍量的冰水，充分勻漿，然后在8000r/min下低溫（4℃）離心20min，重復(fù)3～5次后在沉淀中加入4倍量的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（0.6mol/L KCl，pH7.0），勻漿，于0～4℃的環(huán)境中提取18h，在4℃，8000r/min下離心20min，收集上清液，用雙縮脲法測(cè)定蛋白含量。

1.2.4 活性巰基的測(cè)定方法 活性巰基含量的測(cè)定參考Ellman[5]法，采用DTNB法測(cè)定。

1.2.5 Ca2+-ATPase活性的測(cè)定 Ca2+-ATPase活性的測(cè)定參考Benjakul的方法[6]。

1.2.6 表面疏水性的測(cè)定 采取的ANS熒光探針?lè)╗7]，檢測(cè)的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為380nm和480nm，狹縫寬為5nm。以相對(duì)熒光強(qiáng)度與蛋白質(zhì)濃度作圖，其初始斜率即為蛋白質(zhì)的相對(duì)表面疏水性（ANS-S0）。

1.2.7 乳化性的測(cè)定 采用濁度法[8]測(cè)定肌原纖維蛋白的乳化活性（EAI）和乳化穩(wěn)定性（ESI）。

1.2.8 感官評(píng)定 將冰藏后的羅非魚(yú)感官評(píng)價(jià)人員即時(shí)進(jìn)行評(píng)測(cè)[9]，評(píng)定人員由10位經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的專業(yè)人員組成，分別對(duì)魚(yú)片的色澤、氣味、組織形態(tài)和肌肉彈性進(jìn)行評(píng)定。魚(yú)體的綜合分值在15～20分為一級(jí)鮮度，9～15分為二級(jí)鮮度，8分以下為不新鮮。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析 每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品測(cè)定重復(fù)3～5次，用Origin 7.5進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，其值表示為：平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與討論

2.1 碎冰冷藏對(duì)羅非魚(yú)肉pH的影響

圖1 冰藏對(duì)羅非魚(yú)肉pH的影響Fig.1 Effect of iced storage on the pH value of Tilapia muscle

在碎冰冷藏期間，羅非魚(yú)肌肉pH的變化如圖1所示。由圖1可知，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，隨著冰藏時(shí)間的延長(zhǎng)，其pH呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，于冰藏的第2d達(dá)到最低點(diǎn)（pH6.67），很可能與魚(yú)體糖酵解過(guò)程有關(guān)。魚(yú)體停止呼吸后，組織呼吸轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)氧的糖酵解途徑，糖原分解產(chǎn)生乳酸，所以pH下降，但是隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，羅非魚(yú)體內(nèi)肌原纖維蛋白不斷降解，分解產(chǎn)生堿性物質(zhì)，使得pH又升高[10]。

2.2 碎冰冷藏對(duì)羅非魚(yú)肉肌原纖維蛋白含量的影響

碎冰冷藏期間羅非魚(yú)肌原纖維蛋白含量的變化如圖2所示。冰藏期間，肌原纖維蛋白含量隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。由圖2可知，新鮮羅非魚(yú)的肌原纖維蛋白的提取量并不是最高的，冰藏1d后提取量最大，高達(dá)135.73mg/g。這是由于羅非魚(yú)剛死后，其肌肉內(nèi)ATP的作用，使得肌球蛋白分子與肌動(dòng)蛋白分子呈不可逆的強(qiáng)固結(jié)合，相互聚合形成了分子量較大的分子，在離心時(shí)沉降至沉淀部分[11]。冰藏第1～10d一直呈現(xiàn)迅速下降的趨勢(shì)，貯藏末期趨于平緩。肌原纖維蛋白含量逐漸降低主要是由于冰藏過(guò)程中蛋白質(zhì)變性發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，巰基氧化形成的二硫鍵會(huì)導(dǎo)致肌球蛋白重鏈發(fā)生聚合[12]。

表1 羅非魚(yú)肉的感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria of sensory evaluation of Tilapia muscle

圖2 冰藏對(duì)羅非魚(yú)肉肌原纖維蛋白含量的影響Fig.2 Effect of iced storage on content of myofibrillar protein from Tilapia muscle

2.3 碎冰冷藏對(duì)羅非魚(yú)肉肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性的影響

圖3 冰藏對(duì)羅非魚(yú)肉肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性的影響Fig.3 Effect of iced storage on the activity of Ca2+-ATPase of myofibrillar protein from Tilapia muscle

Ca2+-ATPase活性被廣泛用于表示肌球蛋白完整性的指標(biāo)。在碎冰冷藏期間，羅非魚(yú)肉肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性的變化如圖3所示。由圖3可知，冰藏期間，羅非魚(yú)肉肌原纖維蛋白的Ca2+-ATPase活性隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，其中前6d下降較為迅速，從開(kāi)始的0.42μmolPi/mg·min迅速降至0.18μmol Pi/mg·min，之后變化趨于平緩。引起Ca2+-ATPase活性下降的原因主要為pH下降以及巰基氧化形成二硫鍵導(dǎo)致的分子聚合；可能是由于肌漿球蛋白的球狀頭部構(gòu)象的變化以及這部分蛋白的聚集或者相互作用發(fā)生重排導(dǎo)致的[13]。

2.4 碎冰冷藏對(duì)羅非魚(yú)肉肌原纖維蛋白活性巰基含量的影響

在碎冰冷藏期間，羅非魚(yú)肉肌原纖維蛋白活性巰基含量的變化如圖4所示。由圖4可知，冰藏期間，羅非魚(yú)肌肉中肌原纖維蛋白活性巰基的含量隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。其中前6d活性巰基含量下降較快，從開(kāi)始的9.34×10-5mol/g迅速下降至3.34×10-5mol/g，之后變化趨于平緩。巰基含量的變化主要是肌球蛋白降解，蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使埋藏在分子內(nèi)部的巰基暴露出來(lái)被氧化，導(dǎo)致其含量減少[6]。

圖4 冰藏對(duì)羅非魚(yú)肉肌原纖維蛋白活性巰基的影響Fig.4 Effect of iced storage on the activity of sulfhydryl of myofibrillar protein from Tlapia muscle

2.5 碎冰冷藏對(duì)羅非魚(yú)肉肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

圖5 冰藏對(duì)羅非魚(yú)肉肌原纖維蛋白表面疏水性的影響Fig.5 Effect of iced storage on the surface hydrophobicity of myofibrillar protein from Tilapia muscle

ANS是所用疏水探針中應(yīng)用最廣泛的探針，它通過(guò)非共價(jià)的形式結(jié)合到蛋白質(zhì)分子的非極性區(qū)域，增強(qiáng)了熒光強(qiáng)度。在一定范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度與蛋白質(zhì)的濃度具有較好的線性關(guān)系[7]，這表征了蛋白質(zhì)疏水性基團(tuán)的暴露情況。

在碎冰冷藏期間，羅非魚(yú)肉肌原纖維蛋白表面疏水性的變化如圖5所示。由圖5可知，冰藏期間，肌原纖維蛋白的表面疏水性呈上升趨勢(shì)，但是前4d上升較緩慢，第6～8d迅速上升，第8d后趨于平緩。冰藏期間，疏水性發(fā)生變化是由于不同氨基酸間的疏水作用及巰基的氧化影響了蛋白質(zhì)的疏水性；且由于蛋白質(zhì)的降解和變性作用，會(huì)使埋藏在內(nèi)部的分子暴露出來(lái)，導(dǎo)致疏水性增加[13]。

2.6 碎冰冷藏對(duì)羅非魚(yú)肌原纖維蛋白乳化性的影響

圖6 冰藏對(duì)羅非魚(yú)肉肌原纖維蛋白乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of iced storage on the emulsifying activity and emulsifying stability of myofibrillar protein from Tilapia muscle

在碎冰冷藏期間，羅非魚(yú)肉肌原纖維蛋白乳化性的變化如圖6所示。由圖6可知，冰藏期間肌原纖維蛋白的EAI和ESI均呈下降趨勢(shì)，其中前6d下降較緩慢，后期則迅速下降，貯藏時(shí)間在0～16d分別從41.24m2/g和44.78min下降至10.48m2/g和16.39min。蛋白質(zhì)的乳化特性是蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與脂肪交聯(lián)能力的表征，乳化性受蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象、聚集程度、pH、離子強(qiáng)度、粘度等一系列因素的影響，其中蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象及其聚集程度影響最大[14]。而且有關(guān)研究也表明，蛋白質(zhì)的乳化能力與溶解度呈正相關(guān)，即蛋白質(zhì)的含量越高，其乳化能力越好[15]。在冰藏過(guò)程中，羅非魚(yú)體內(nèi)肌原纖維蛋白不斷發(fā)生變性降解，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子空間構(gòu)象發(fā)生變化，且蛋白質(zhì)含量逐漸降低，因而乳化性和乳化穩(wěn)定性逐漸降低。

2.7 碎冰冷藏對(duì)羅非魚(yú)肌肉感官的影響

圖7 冰藏對(duì)羅非魚(yú)肌肉感官分值的影響Fig.7 Effect of iced storage on the sensory evaluation value of Tilapia muscle

在碎冰冷藏期間，羅非魚(yú)肉肌原纖維蛋白感官的變化如圖7所示。綜合感官評(píng)分在冰藏期間隨著冰藏時(shí)間的延長(zhǎng)而越來(lái)越低。在冰藏的前6d，魚(yú)肉一直保持著一級(jí)鮮度的狀態(tài)；冰藏的前10d內(nèi)，其品質(zhì)也一直保持新鮮的狀態(tài)，仍然可以食用；但是在冰藏后期其肌肉呈現(xiàn)腐敗的跡象，主要表現(xiàn)為顏色變暗，肉質(zhì)松散，并且有不良?xì)馕兜纳?，不宜食用。因此碎冰冷藏?duì)于羅非魚(yú)的短期貯藏效果很好，為羅非魚(yú)的貯藏、運(yùn)輸和銷售提供了理論依據(jù)。另外，冰藏期間，由于微生物和酶的作用，羅非魚(yú)體內(nèi)蛋白質(zhì)會(huì)逐漸降解變性，導(dǎo)致硫化氫、氨、甲硫醇、腐胺、尸胺、吲哚、四氫吡咯院等化合物的生成，導(dǎo)致顏色變暗并呈現(xiàn)異味；魚(yú)體之所以會(huì)變軟的原因主要有兩種說(shuō)法：一種認(rèn)為冷藏過(guò)程中，由于某種生化變化使結(jié)締組織的機(jī)械強(qiáng)度下降，導(dǎo)致魚(yú)肉軟化；也有人認(rèn)為與肌原纖維的Z盤的脆弱化、肌動(dòng)球蛋白復(fù)合體的解離、肌聯(lián)蛋白的結(jié)構(gòu)變化或者結(jié)締組織的變性有關(guān)[2]。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)冰藏條件下對(duì)羅非魚(yú)pH、肌原纖維蛋白的蛋白質(zhì)含量、Ca2+-ATPase活性、活性巰基含量、乳化性和感官品質(zhì)等理化特性影響的研究，發(fā)現(xiàn)羅非魚(yú)的pH在冰藏期間呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)；肌原纖維蛋白溶出量則呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)；Ca2+-ATPase活性、巰基含量、乳化性以及感官評(píng)價(jià)均隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低；表面疏水性則隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高；通過(guò)感官評(píng)定發(fā)現(xiàn)貯藏前6d內(nèi)羅非魚(yú)的品質(zhì)一直處于一級(jí)鮮度的狀態(tài)，并且到第10d品質(zhì)仍保持新鮮，可以食用。

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