BHA誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)細胞

王衛(wèi)民，丁妍

(1.湖北十堰市太和醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，湖北十堰 442000;2.湖北十堰市太和醫(yī)院生命科學(xué)研究所，湖北十堰 442000)

人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)是來源于人臍帶基質(zhì)Whaton's jelly的一種干細胞，表達MSC的表面標志CD105、CD90及 CD44。最近的一些研究表明，hUC-MSCs具有免疫抑制及抑制T細胞增殖的作用［1］。而且hUC-MSCs抑制還能改善缺血性休克以及由多巴胺能神經(jīng)元損傷和脊髓損傷而導(dǎo)致的帕金森?。?］，保護新生鼠腦白質(zhì)軟化灶的神經(jīng)［3］。

目前，關(guān)于MSCs體外分化為神經(jīng)元樣細胞的報道較多，誘導(dǎo)方法各異，結(jié)果也不盡相同［4］。只有尋找到最簡便、快速、毒性低的誘導(dǎo)途徑，才能使hUCMSCs的臨床應(yīng)用真正變?yōu)楝F(xiàn)實。丁基羥基茴香醚(butyl hydroxyanisole，BHA)是一種很好的抗氧劑，本研究探討其是否能在體外將hUC-MSCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細胞，以期找到相對較適合的誘導(dǎo)條件，為hUC-MSCs移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病奠定實驗基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 主要試劑

低糖 DMEM、胎牛血清(Hyclone)，胰蛋白酶(Gibco)，L-谷氨酰胺(Sigma)，碘化丙啶(PI，Sigma)，小鼠抗人巢蛋白(nestin)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)及神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白質(zhì)(glial fibrillary acidic protein，GFAP)抗體(美國Santa)，Cy3標記的羊抗鼠二抗、FITC-標記的羊抗鼠二抗(北京天根生物技術(shù)有限公司)，BHA、DMSO(美國Sigma)，RT-PCR試劑盒(安特捷)。

1.2 hUC-MSCs的培養(yǎng)

培養(yǎng)基為DMEM+10%FBS，細胞鋪滿整個培養(yǎng)瓶的底部即用0.05%胰蛋白酶/0.04%EDTA消化、分離傳代，大約每3～4 d傳代1次，本實驗中所用到的細胞為P4～P6。

1.3 體外定向誘導(dǎo)hUC-MSCs向神經(jīng)細胞分化

將3至5代的細胞懸液接種于直徑40 mm塑料培養(yǎng)皿中，細胞生長達80%至90%融合時開始進行誘導(dǎo)分化。實驗組:先用DMEM培養(yǎng)基加10%FBS加1 mmol·L－1巰基乙醇(β-ME)誘導(dǎo) 24 h，再換成DMEM培養(yǎng)基加2%DMSO 加200 μmol·L－1BHA 加2 mmol·L－1β-ME 誘導(dǎo)72 h。對照組:不加任何誘導(dǎo)劑。誘導(dǎo)過程中在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。

1.4 鑒定分化的神經(jīng)樣細胞

1.4.1 RT-PCR鑒定 分別于誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后1 d、誘導(dǎo)后3 d收集細胞，提取總RNA(Trizol法)，RT-PCR按試劑盒操作說明進行，引物序列、產(chǎn)物大小見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.4.2 免疫熒光鑒定 實驗組細胞誘導(dǎo)1、3 d后進行神經(jīng)干細胞標記物巢蛋白、神經(jīng)元細胞標記物NSE及星形膠質(zhì)細胞標記物GFAP免疫細胞化學(xué)鑒定。具體染色步驟如下:PBS(pH 7.4)洗滌細胞;4%多聚甲醛固定30 min以上，PBS洗滌3次，每次5 min;非免疫性動物血清封閉，室溫10 min;分別滴加巢蛋白單抗(1∶50)、NSE 單抗(1∶50)、GFAP 單抗(1∶50)，4 ℃過夜;PBS沖洗3次，每次5 min;滴加二抗:Cy3標記或FITC標記的羊抗鼠二抗(1∶200)，37℃孵育60 min，PBS沖洗3次，每次3 min;Hoechst 33342染核5～10 min，PBS沖洗3次，每次5 min，熒光顯微鏡下觀察并照相。

2 結(jié) 果

2.1 加入誘導(dǎo)液后倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化

本實驗中加入BHA進行誘導(dǎo)后12 h開始有少量細胞發(fā)生形態(tài)變化:原本寬大而扁平的細胞開始變小，胞體變圓變亮，折光性增強，開始出現(xiàn)細小的突起;誘導(dǎo)24 h后，大部分細胞發(fā)生類似上述形態(tài)改變;72 h后呈現(xiàn)明顯的神經(jīng)細胞樣形態(tài)，相鄰的細胞間軸突聯(lián)結(jié)成網(wǎng)狀，誘導(dǎo)的神經(jīng)樣細胞形態(tài)不一，有簡單的雙極細胞，也有復(fù)雜的多極細胞。少數(shù)誘導(dǎo)細胞胞體較大，突起較多，較獨立存在，類似膠質(zhì)細胞。有少部分細胞始終未發(fā)生形態(tài)改變，仍保持寬大扁平狀。熒光染色巢蛋白、GFAP及NSE均為陽性，但NSE陽性細胞最多，達90%以上，巢蛋白陽性細胞次之，約50%，GFAP陽性細胞極少，不到1%(圖1)。

2.2 RT-PCR檢測誘導(dǎo)后不同時間點各基因的表達情況

誘導(dǎo)前MSC表達少量的巢蛋白，誘導(dǎo)24 h后巢蛋白表達升高，同時開始有MAP2及NF-L表達;誘導(dǎo)72 h后巢蛋白及NF-L表達較24 h有所降低，但MAP-2表達明顯升高，而且NeuroD1也有較高表達。見圖2。

3 討 論

雖然骨髓是MSCs的主要來源，但是利用骨髓來源的細胞并不總是可取的，因為骨髓采集本身就是一個有創(chuàng)的操作，該過程中病毒的暴露率、捐獻者發(fā)病率都會升高，而且細胞的數(shù)量、增殖能力、分化能力都會隨著年齡的增長而降低。而臍帶為分娩后廢棄物，hUC-MSCs的獲取過程為非侵襲性操作，無倫理限制，相關(guān)污染率也遠低于骨髓來源MSCs，因此hUC-MSCs成為臨床上最具應(yīng)用前景的多能干細胞［5］。

目前用于誘導(dǎo)MSCs向神經(jīng)細胞分化的因子主要有維甲酸(retinoicacid，RA)［6］、細胞生長因子 bFGF 和EGF、去甲基試劑5-氮胞苷和生長因子以及noggin［7］。此外一些具有抗氧化特性的中藥如丹參注射液［8］、麝香多肽［9］等也可誘導(dǎo) MSCs分化為神經(jīng)元樣細胞。BHA是抗氧化劑，能促進谷胱甘肽的合成，誘導(dǎo)細胞增殖分化［10］。β-ME能保護神經(jīng)細胞在無血清培養(yǎng)基中的存活，促進軸突的顯著增長，促進谷胱甘肽的合成，清除氧自由基［11］。已有研究報道β-ME和BHA能誘導(dǎo)人胎肝CD34+細胞［12］及表觀修飾后的NIH/3T3細胞［13］分化為神經(jīng)細胞，因而我們設(shè)想這兩種因子也能快速地將hUC-MSCs誘導(dǎo)為神經(jīng)細胞。

圖1 BHA誘導(dǎo)后細胞形態(tài)變化及免疫熒光檢測 A.對照組相差顯微鏡下不同時間細胞形態(tài)保持不變，細胞密度增加 ×40;B.誘導(dǎo)組相差顯微鏡下不同時間細胞形態(tài)變化 ×100;C.免疫熒光檢測神經(jīng)細胞相關(guān)基因巢蛋白、GFAP及NSE ×100

圖2 誘導(dǎo)前后神經(jīng)細胞相關(guān)基因表達情況 A～C為RT-PCR電泳圖;D為A～C的直方圖

本實驗應(yīng)用β-ME及抗氧化劑BHA誘導(dǎo)hUCMSCs向神經(jīng)細胞分化。誘導(dǎo)72 h后發(fā)現(xiàn)，有較多的分化細胞表達神經(jīng)元標記物NSE，少量分化細胞表達膠質(zhì)細胞標記物GEAP。NSE是神經(jīng)細胞特異標志之一，在神經(jīng)發(fā)育的早、中、晚期均表達。RT-PCR檢測誘導(dǎo)24及72 h時神經(jīng)細胞標記物巢蛋白、NF-L、MAP-2及NeuroD1的表達情況，結(jié)果顯示，誘導(dǎo)24 h后巢蛋白的表達率較高，72 h后有所下降，表明神經(jīng)干細胞在誘導(dǎo)過程中逐漸分化為神經(jīng)細胞而數(shù)量逐漸減少。NF-L的表達量24 h時升高，72 h時下降，而MAP2和NeuroD1的表達量逐漸增多。巢蛋白和NFL是在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中表達的中間絲蛋白，是神經(jīng)干細胞和神經(jīng)前體細胞的標記［14］。BHA誘導(dǎo)hUCMSCs分化為神經(jīng)元的過程為:先使其分化為神經(jīng)干細胞，然后再進一步分化為成熟的神經(jīng)元。因而在誘導(dǎo)初期巢蛋白和NF-L的表達量增多，隨后又下降。MAP2是神經(jīng)細胞特異微管相關(guān)蛋白，能使神經(jīng)細胞維持正常的形態(tài)和功能，是成熟神經(jīng)元特有的結(jié)構(gòu)，位于神經(jīng)元的胞體和樹突，出現(xiàn)在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育晚期及成年期，有穩(wěn)定神經(jīng)元微管和保持神經(jīng)元形態(tài)的作用［15］;NeuroD1是一種神經(jīng)元分化因子。這二者都是神經(jīng)元特異性的標志，隨著誘導(dǎo)的進行，分化成熟的神經(jīng)元越來越多，因而其表達量是逐漸增多的。

綜上所述，β-ME和BHA能快速將hUC-MSCs分化為神經(jīng)元。但是分化而成的神經(jīng)元是否具有功能?這一問題我們將在后續(xù)的研究中進行探討。關(guān)于β-ME和BHA誘導(dǎo)hUC-MSCs分化為神經(jīng)元的具體機制目前尚不得而知，可能與其抗氧化、促進谷胱甘肽的合成及誘導(dǎo)細胞增殖分化有關(guān)。

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