PI3K-Akt信號(hào)通路對(duì)人大腸癌hct-8/FU耐藥細(xì)胞P-GP表達(dá)和耐藥性的影響

張勁遠(yuǎn)，張銀旭，張俊華

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院普通外科，遼寧錦州 121001)

近年來一些細(xì)胞信號(hào)分子的抑制劑已經(jīng)用于腫瘤的臨床治療，針對(duì)PI3K-Akt信號(hào)通路中多個(gè)分子抑制劑(如Wortmannin和LY294002)在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中都有抗腫瘤活性，并且可增加腫瘤細(xì)胞對(duì)其他靶點(diǎn)治療、化療和放療的敏感性［1］。近年研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是導(dǎo)致腫瘤化療失敗的重要原因［2］。P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-GP)是引起MDR的主要分子，但因其調(diào)控機(jī)制不明，至今仍無法克服其介導(dǎo)的耐藥。研究表明，P-GP的功能受多種信號(hào)蛋白的調(diào)節(jié)［3-5］，磷脂酰肌醇3-激酶-(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)和其下游分子蛋白激酶B(protein kinase B，PKB或Akt)所組成的PI3K-Akt信號(hào)通路是調(diào)控細(xì)胞生存的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一。最新研究證實(shí)，激活前列腺癌細(xì)胞PI3K-Akt通路，可上調(diào)P-GP的表達(dá)［6］，所以阻滯PI3K-Akt信號(hào)傳導(dǎo)路徑可能影響P-GP的活性表達(dá)，并對(duì)腫瘤細(xì)胞耐藥性產(chǎn)生影響。我們以結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株為模型，探討抑制PI3K-Akt通路對(duì)結(jié)腸癌hct-8/FU P-GP蛋白表達(dá)的影響及對(duì)耐藥細(xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用。

1 材料和方法

1.1 材料

人結(jié)腸癌細(xì)胞株hct-8及人結(jié)腸癌MDR細(xì)胞株hct-8/FU(南京凱基生物科技公司)，5-FU(天津金耀氨基酸有限公司)，PI3K抑制劑LY294002(Sigma公司)，PI3K、Akt、P-Akt、P-GP 抗體(Cell Signaling 公司)，鼠抗人β-actin多克隆抗體(博士德生物技術(shù)公司)，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)儀Bioshine(上海歐翔科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞株培養(yǎng)及分組 在含100 ml·L－1小牛血清的 RPMI 1640 培養(yǎng)液中，37 ℃，50 ml·L－1CO2飽和濕度條件下連續(xù)培養(yǎng)。hct-8采用藥物持續(xù)接觸濃度遞增誘導(dǎo)法，直到能在含5-FU濃度為40 mmol·L－1的培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長，并命名為hct-8/FU。實(shí)驗(yàn)設(shè)hct-8、hct-8/FU及hct-8/FU加藥(加LY294002)組3組，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 藥物敏感性測(cè)定 將對(duì)數(shù)生長期hct-8、hct-8/FU和hct-8/FU加藥組細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，采用MTT法連續(xù)檢測(cè)7 d，繪制細(xì)胞生長曲線。

不同濃度梯度組的5-FU分別作用于hct-8和hct-8/FU細(xì)胞，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，MTT法計(jì)算IC50值，用酶標(biāo)儀(波長490 nm)測(cè)吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞抑制率。細(xì)胞抑制率=(對(duì)照組A值－實(shí)驗(yàn)組A值)/對(duì)照組A值×100%。用LY294002預(yù)處理上述各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，觀察其耐藥性的變化。hct-8及hct-8/FU組加入 LY294002 的終濃度為 20 μmol·L－1。

1.2.3 免疫印跡法檢測(cè) PI3K、Akt、P-Akt、P-GP 蛋白表達(dá) 于對(duì)數(shù)生長期分別收獲各組細(xì)胞進(jìn)行SDSPAGE 凝膠電泳、半干法轉(zhuǎn)?。?］，以 PI3K、P-GP、PAkt、Akt單抗(1∶400稀釋)作為一抗，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶800)，孵育后ECL顯色(按試劑盒說明書操作)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

各實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 hct-8、hct-8/FU和hct-8/FU加藥組的生長曲線

細(xì)胞以貼壁方式生長，hct-8細(xì)胞的倍增時(shí)間為33.50 h，hct-8/FU細(xì)胞為48.79 h，hct-8/FU加藥組為41.70 h。以生長時(shí)間為橫坐標(biāo)、細(xì)胞數(shù)量為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線如圖1。

圖1 3組細(xì)胞生長曲線

2.2 不同濃度5-FU下各組細(xì)胞的生長抑制率及IC50

各組細(xì)胞生長抑制率詳見圖2。hct-8細(xì)胞對(duì)5-FU的 IC50值為(43.2±1.4)mg·L－1;hct-8/FU 細(xì)胞IC50值為(516.00 ± 20.03)mg·L－1，耐藥倍數(shù)為11.9;HCT-8/FU加藥組IC50值為(58.2±4.3)mg·L－1，耐藥倍數(shù)為 1.37，逆轉(zhuǎn)指數(shù)為 8.86。LY294002對(duì)hct-8和hct-8/FU細(xì)胞增殖有顯著抑制作用，LY294002 40 μmol·L－1聯(lián)合 5-FU 作用時(shí)，各濃度組抑制率與單用5-FU相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可以看出，LY294002聯(lián)合5-FU給藥比單用5-FU對(duì)hct-8和hct-8/FU細(xì)胞生長的抑制作用要強(qiáng)。

圖2 不同濃度5-FU下hct-8、hct-8加藥、hct-8/FU和hct-8/FU加藥組細(xì)胞的生長抑制率

2.3 免疫印跡法檢測(cè)5-FU、LY294002對(duì)Hct-8和Hct-8/FU細(xì)胞 PI3K、Akt、P-Akt和 P-GP表達(dá)的影響

利用蛋白質(zhì)印跡法半定量分析進(jìn)一步驗(yàn)證PI3K、Akt、P-Akt和P-GP在hct-8和hct-8/FU細(xì)胞中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示:在hct-8和hct-8/FU細(xì)胞中，hct-8細(xì)胞對(duì)照組PI3K、Akt、P-Akt及P-GP蛋白相對(duì)濃度值均低于hct-8/FU細(xì)胞對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為 26.005和 23.477，均 P＜0.05)，加用LY294002 后 PI3K、Akt、P-Akt及 P-GP 表達(dá)均低于未加藥組。該結(jié)果提示，抑制PI3K-Akt通路后可能影響下游蛋白P-GP表達(dá)進(jìn)而與hct-8、hct-8/FU細(xì)胞間的耐藥性差異有關(guān)，見圖3。

圖3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)hct-8、hct-8/FU、hct-8/FU加藥組3組細(xì)胞 P-Akt、PI3K、Akt、P-GP 的表達(dá)

3 討 論

PI3K-Akt信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、治療及轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮重要作用。近年研究顯示，PI3K-Akt通路抑制劑Wortmannin能促進(jìn)胃癌細(xì)胞BGC-823凋亡，增強(qiáng)抗腫瘤化療藥物足葉乙甙和多柔比星的療效，提示PI3K-Akt通路失活與胃癌化療敏感性有關(guān)［7］;同時(shí)研究［8-9］表明，PI3K-Akt信號(hào)途徑還與腫瘤MDR密切關(guān)聯(lián)，PI3K-Akt的激活可以導(dǎo)致進(jìn)展期前列腺癌細(xì)胞MDR蛋白1(MRP1)的表達(dá)和繼發(fā)MDR的發(fā)生;在耐藥的結(jié)腸腺癌細(xì)胞HT29RDB中，PI3K-Akt信號(hào)途徑的阻滯劑LY294002與阿霉素聯(lián)合使用能夠在MRP1介導(dǎo)的耐藥機(jī)制中發(fā)揮治療作用，可使細(xì)胞內(nèi)阿霉素藥物濃度增加3倍以上。

PI3K-Akt通路已經(jīng)成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)，P-GP在腫瘤治療過程中對(duì)腫瘤細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生發(fā)揮重要作用，腫瘤細(xì)胞中P-GP利用ATP水解釋放的能量降低細(xì)胞內(nèi)藥物的濃度，從而產(chǎn)生耐藥性。關(guān)于結(jié)腸癌細(xì)胞P-GP的表達(dá)調(diào)控是否依賴于PI3K信號(hào)通路的研究目前報(bào)道很少，進(jìn)一步弄清這一信號(hào)通路不僅對(duì)更清楚地闡明大腸癌化療耐藥的分子機(jī)制具有重要的理論意義，而且對(duì)防治結(jié)腸癌的耐藥性產(chǎn)生和提高耐藥病人化療效果具有重要的實(shí)用價(jià)值。結(jié)腸癌細(xì)胞的耐藥機(jī)制目前還不完全清楚，研究表明，Akt能夠通過磷酸化其下游的多種作用底物促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、增殖，抑制細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞的缺氧耐受，促進(jìn)血管生成，腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移以及對(duì)化療和放療的抵抗［10］。Zhang 等［11］發(fā)現(xiàn)下調(diào) Akt表達(dá)可抗腫瘤治療。

本研究顯示，hct-8/FU 細(xì)胞中 PI3K、Akt、P-Akt、P-GP蛋白表達(dá)水平高于hct-8細(xì)胞，應(yīng)用LY294002抑制PI3K-Akt蛋白表達(dá)可增強(qiáng)hct-8細(xì)胞對(duì)5-FU的藥物敏感性，特別是在hct-8/FU細(xì)胞，應(yīng)用LY294002抑制PI3K-Akt蛋白表達(dá)后細(xì)胞對(duì)5-FU藥物敏感性接近其親本(hct-8細(xì)胞)水平，提示PI3K-Akt信號(hào)通路異常與結(jié)腸癌對(duì)5-FU耐藥有關(guān)，抑制PI3K-Akt信號(hào)通路能逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌對(duì)5-FU耐藥表型。此外，我們應(yīng)用LY294002抑制PI3K-Akt信號(hào)通路后，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)hct-8和hct-8/FU細(xì)胞中耐藥蛋白P-GP表達(dá)降低，提示LY294002可能通過抑制PI3K-Akt通路激活進(jìn)而抑制下游蛋白分子P-GP表達(dá)從而逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌細(xì)胞耐藥。

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