基于光子懸浮列陣多元檢測腫瘤標(biāo)志物的初步研究

盧穎輝，何杰，田小強(qiáng)，常立功，黃培林

(1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009;2.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院 病理科，安徽合肥 230000)

由于單個標(biāo)志物往往不能準(zhǔn)確診斷某種腫瘤，所以研發(fā)新型具有高通量聯(lián)合檢測多種腫瘤標(biāo)志物的方法就顯得格外重要。目前常用的傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物檢測方法常只能檢測單個腫瘤標(biāo)志物，在需檢測多個標(biāo)志物時會造成資源浪費［1-2］。相對于傳統(tǒng)的檢測方法，多元檢測技術(shù)具有高通量、高靈敏度、節(jié)省待測樣本、縮短檢測時間、降低檢測成本等優(yōu)勢［3］。

本研究采用基于膠體晶體微球編碼載體的多元檢測技術(shù)檢測腫瘤標(biāo)志物。這種微列陣的載體是二氧化硅膠體晶體微球(silica crystal colloidal spheres，SCCBs)。這些載體的編碼是源于它們結(jié)構(gòu)周期性的特有的反射峰，所以不會有諸如褪色、漂白、粹滅以及化學(xué)不穩(wěn)定等問題［4-5］。另外，由于沒有染色和與熒光相關(guān)的物質(zhì)存在，所以SCCBs的背景很低［6-7］。在本研究中，我們在成功構(gòu)建SCCBs微列陣的基礎(chǔ)上，應(yīng)用雙抗夾心法對人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株蛋白提取物中的Bcl-2、p21蛋白進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果與傳統(tǒng)ELISA方法進(jìn)行比對，初步探討基于SCCBs的微列陣多元檢測技術(shù)的可行性、高通量及其高靈敏度等特點。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株SHG-44由蘇州大學(xué)提供，DMEM高糖培養(yǎng)基在細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑 鼠抗人Bcl-2抗體、鼠抗人p21抗體、異硫氰酸熒光素(FITC標(biāo)記)標(biāo)記的二抗均購自BD公司，牛血清蛋白(BSA)購自Sigma公司，5%的PBS緩沖液(pH 7.4)、SCCBs由東南大學(xué)生物電子國家重點實驗室提供，細(xì)胞裂解液以及CBA蛋白定量試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所，人Bcl-2、p21蛋白ELISA試劑盒均購自南京迪堯生物技術(shù)公司。

1.1.3 主要儀器 金相顯微鏡(OLYMPUS BX51)、熒光倒置顯微鏡(OLYMPUS IX71)、高靈敏度彩色CCD攝像頭(Evolution MP 5.0)、高靈敏度冷CCD(DP30)、光纖光譜儀(USB2000-FLG，QE65000)、細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀等。

1.2 實驗方法

1.2.1 構(gòu)建SCCBs懸浮微列陣 通過預(yù)實驗摸出最合適的時間和溫度，標(biāo)記上探針，構(gòu)建最佳狀態(tài)的懸浮微列陣。探針分子是通過共價結(jié)合固定在SCCBs表面的。首先，SCCBs作親水處理，在濃硫酸與雙氧水7∶3的溶液中浸泡48 h，用純水洗干凈，烘干后用10%的G-PTMS甲醛溶液浸泡過夜，分別用甲醛和乙醇溶液洗，然后用純水洗干凈。SCCBs標(biāo)探針。本研究用的10 μl體系每管都是10 μl、5 個微球。將10 μl的一抗加到EP管里，4℃過夜。

1.2.2 免疫檢測 應(yīng)用雙抗夾心法，首先用不同濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)液測量標(biāo)準(zhǔn)曲線;再用同一條件的微列陣定量檢測從人膠質(zhì)瘤細(xì)胞提取的總蛋白中的Bcl-2、p21蛋白。檢測在同一試管中進(jìn)行。

將孵育過夜的微球用PBS緩沖液洗3～4遍，每次5 min;加5%的BSA蛋白溶液封閉2 h，條件是37℃振蕩搖勻;封閉過后的微球要用PBS緩沖液洗4～5遍，每次5 min;再加待測蛋白標(biāo)準(zhǔn)品或者細(xì)胞蛋白樣品孵育30 min，37℃振蕩搖勻;標(biāo)準(zhǔn)品的配制與樣品的稀釋都用PBS緩沖液;然后用PBS緩沖液洗4～5遍，每次5 min;洗完后孵育 FITC標(biāo)記的二抗30 min，37℃振蕩搖勻;孵育過后用PBS緩沖液洗4～5遍，每次5 min。在熒光顯微鏡下觀察并記錄熒光。

在進(jìn)行多元腫瘤標(biāo)志物檢測時，不同編碼的SCCBs表面固定各自的探針分子，并被混合在一起置于同一試管內(nèi)。

ELISA檢測，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別檢測蛋白提取物中的Bcl-2、p21蛋白，所有實驗重復(fù)3次以上。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS統(tǒng)計軟件分析，組間比較采用t檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 基于SCCBs的懸浮列陣的構(gòu)建

如圖1所示，5種光子 SCCBs的反射峰分別是447、510、562、592 和 617 nm，我們從 5 種微球中選出兩種反射峰居中而又有一定差別的微球(微球反射峰分別是510、592 nm)用于下一步研究。

圖1 5種微球的光譜圖Fig 1 Reflection spectra of the five kinds of SCCBs

2.2 用懸浮微列陣方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

用懸浮微列陣方法檢測得到Bcl-2和p21的線性范圍分別是9 ～180 ng·ml－1和0.05 ～1 ng·ml－1。

圖2、3為Bcl-2、p21蛋白的濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。跟傳統(tǒng)的免疫分析結(jié)果一致，呈現(xiàn)非線性，將其進(jìn)行曲線擬合處理。結(jié)果分析顯示，以上兩種腫瘤標(biāo)記物的檢測下限(信噪比為3σ)分別為1 ng和0.049 ng?；赟CCBs載體的多元檢測方法在腫瘤分析中的靈敏度以及檢測范圍適合臨床應(yīng)用。

圖2 Bcl-2的濃度與熒光強(qiáng)度關(guān)系曲線圖Fig 2 Calibration plots of fluorescence intensity vs Bcl-2 tumor marker concentrations

圖3 p21的濃度與熒光強(qiáng)度關(guān)系曲線圖Fig 3 Calibration plots of fluorescence intensity vs p21 tumor marker concentrations

2.3 樣品檢測結(jié)果

對30份細(xì)胞總蛋白樣本進(jìn)行檢測并對每個標(biāo)記物檢測的數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析，得到如圖4所示的分析結(jié)果關(guān)系圖。由圖中我們可以發(fā)現(xiàn)，基于SCCBs編碼載體所獲得的腫瘤標(biāo)記物檢測結(jié)果和商業(yè)化方法獲取的檢測結(jié)果具有較高的一致性。結(jié)果如下所示(x列:ELISA;y列:光子懸浮列陣):

p21:y=0.928 1x+0.110 7(R2=0.988 9)

Bcl-2:y=0.951 7x+5.403(R2=0.988 6)

圖4 基于SCCBs載體技術(shù)和ELISA樣本檢測結(jié)果 橫坐標(biāo)為ELISA檢測結(jié)果，縱坐標(biāo)為光子懸浮陣列技術(shù)檢測結(jié)果Fig 4 Correlation between the photonic suspension array and the standard ELISA method for the two tumor marker

這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步證明了我們開發(fā)的多元檢測技術(shù)與傳統(tǒng)的檢測方法一樣具有較好的分析可靠性。另外，基于SCCBs編碼載體的檢測方法消耗更少的樣品量，并可以在同一試管內(nèi)完成兩種腫瘤標(biāo)記物的檢測，極大地簡化了免疫檢測過程。

3 討 論

腫瘤標(biāo)記物的檢測在癌癥的早期篩查、正確分型、治療評估及預(yù)后、復(fù)發(fā)預(yù)測等方面具有重要意義，特別是多種腫瘤標(biāo)記物的聯(lián)合檢測，對臨床腫瘤的準(zhǔn)確診斷至關(guān)重要［8-10］。目前常用的有效的檢測方法只能分別檢測某一種腫瘤標(biāo)記物，常無法準(zhǔn)確反映疾病的本質(zhì)，臨床應(yīng)用價值有待進(jìn)一步探討。目前所采用的多元檢測的方法各式各樣，但是大多都是基于生物分子的固定和識別。為了同時區(qū)分不同的檢測事件，生物分子必須被編碼。但是生物探針分子的這種編碼其位置或者坐標(biāo)必須是固定的，靶分子要到達(dá)探針分子位置并與之反應(yīng)，這一過程受擴(kuò)散速度的限制，因此這會影響靶分子和探針分子的反應(yīng)速度，令檢測所需時間延長［11-12］。

近年來，將探針分子固定在微球表面的微列陣技術(shù)為多元檢測提供了巨大的技術(shù)支撐［13-14］。在本研究中，利用基于SCCBs編碼載體的多元檢測技術(shù)檢測腫瘤標(biāo)記物，我們首先優(yōu)化了腫瘤標(biāo)記物探針分子在SCCBs表面的固定條件及微球表面探針與標(biāo)記物反應(yīng)的條件，提高了檢測靈敏度。我們研究了物理吸附的方法和化學(xué)偶聯(lián)的方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SCCBs高溫處理后其親水效果明顯，可以被水完全浸潤，這就導(dǎo)致了以疏水作用為主的探針分子在微球表面物理吸附的效率低下。另外，探針分子在微球表面吸附的變異系數(shù)也較高，導(dǎo)致檢測結(jié)果缺乏準(zhǔn)確性。相比而言，以化學(xué)偶聯(lián)法在微球表面固定探針分子具有更高的穩(wěn)定性及固定效率。從微球大小和反應(yīng)時間等方面進(jìn)行優(yōu)化，我們發(fā)現(xiàn)，微球的熒光強(qiáng)度在孵育了30 min之后達(dá)到飽和。在反應(yīng)時間方面，這種微列陣的雙抗夾心免疫孵育時間比傳統(tǒng)ELISA方法的1～3 h短很多，這是因為SCCBs有很高的比表面積，使免疫反應(yīng)速度大大提高。在檢測所需要樣品的量方面，由于基于SCCBs的微列陣是在一個試管內(nèi)同時檢測兩種微球，所以每管檢測樣品只需加10 μl，而ELISA方法只能1個孔測1種蛋白，所以要測兩種蛋白就要用20 μl的樣品。如果待測物再增多的話，基于SCCBs微列陣方法就會節(jié)省非?？捎^的待測樣品。在檢測高通量方面，傳統(tǒng)的ELISA方法是單一檢測的，而本研究中的新方法有報道稱可以同時檢測上百種待測樣品。由于此技術(shù)是在1個試管內(nèi)檢測多種標(biāo)記物，使其檢測過程大大簡化，效率大大提高。

基于SCCBs的多元檢測技術(shù)與傳統(tǒng)的ELISA方法分別對人膠質(zhì)瘤細(xì)胞蛋白提取物中Bcl-2蛋白、p21蛋白的檢測結(jié)果進(jìn)行比對，顯示兩種方法檢測結(jié)果具有較高的一致性。此外，較之ELISA法，基于SCCBs的多元檢測方法可明顯降低樣品量，并可以在同一反應(yīng)體系內(nèi)完成多種腫瘤標(biāo)記物的檢測，極大地簡化了免疫檢測過程。由此可見，基于SCCBs編碼載體的多元檢測技術(shù)在基因研究、藥物篩選、臨床診斷等方面具有廣泛的應(yīng)用前景。在本研究中，一種新型的多元檢測方法被應(yīng)用于腫瘤標(biāo)記物的檢測，這種方法就是懸浮微列陣。SCCBs作為這種微列陣的載體，其表面是納米粒子，這樣可以大大減小空間位阻，提高反應(yīng)動力學(xué)。因此，光子懸浮陣列特別適合檢測疾病診斷標(biāo)記物，值得進(jìn)一步完善和探索。

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