非小細(xì)胞肺癌組織中PTEN基因與Ki67蛋白的表達(dá)及其意義

紀(jì)勇，張梓威，陳靜瑜，鄭明峰，吳小波，衛(wèi)棟

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫市人民醫(yī)院心胸外科，江蘇無錫 214023)

肺癌是常見的惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率和死亡率呈明顯上升趨勢(shì)。磷酸酶-張力蛋白酶(PTEN)基因定位于染色體10q23，是迄今為止人類發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)具有磷酸化酶功能的抑癌基因［1-2］。作為磷酸肌醇-3激酶(PI3K)/絲-蘇氨酸激酶(AKT)通路的負(fù)調(diào)控因子，PTEN基因的正常表達(dá)可以抑制細(xì)胞的惡變以及腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移、生長，該基因異常突變將導(dǎo)致其抑癌作用缺失，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)［3-4］。Ki67是與細(xì)胞增殖相關(guān)的核抗原，與腫瘤增殖、侵襲性密切相關(guān)［5］。本研究通過免疫組化法檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)組織及其癌旁正常肺組織中PTEN和Ki67蛋白的表達(dá)，并結(jié)合臨床及病理學(xué)特征進(jìn)行分析，旨在探討二者在NSCLC中的表達(dá)及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

67例手術(shù)標(biāo)本取自我院2009年6月至2011年5月收治的肺癌患者，并經(jīng)術(shù)后病理診斷證實(shí)為NSCLC。其中男33例，女34例，年齡39～80歲，平均(61±4)歲。所有病例按照國際抗癌聯(lián)盟(UICC)的診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理分期:Ⅰ期20例，Ⅱ期29例，Ⅲ期18例;鱗癌28例，腺癌3l例，大細(xì)胞癌8例;低分化25例，高、中分化42例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者29例，無轉(zhuǎn)移者38例。同時(shí)選取距腫瘤組織＞5 cm的41例正常肺組織作為對(duì)照。全部病例術(shù)前均無放療和化療。

1.2 試劑與方法

抗體、S-P試劑盒均購自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司。切除標(biāo)本用10%甲醛固定，石蠟包埋，蠟塊以4 μm連續(xù)切片，分別進(jìn)行免疫組化和HE染色。免疫組化采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法(SP法):二甲苯透明，微波抗原修復(fù);0.3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，血清封閉，分別滴加Ki67和PTEN一抗;于4℃冰箱中過夜，依次滴二抗及鏈霉卵白素，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，分化、脫水、透明封片。用已知的陽性切片作為陽性對(duì)照，用PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定

PTEN、Ki67在細(xì)胞中出現(xiàn)棕黃色細(xì)顆粒為陽性細(xì)胞。根據(jù)染色陽性的細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比判斷:陽性率＜5%者為陰性;5%～20%為陽性(+)，＞20%者為強(qiáng)陽性(++)，定義(+)以上為陽性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，運(yùn)用χ2檢驗(yàn)、Spearman等級(jí)相關(guān)分析等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 NSCLC及癌旁正常肺組織中PTEN和Ki67的表達(dá)

PTEN的陽性表達(dá)為胞漿內(nèi)存在不同染色程度的棕黃色顆粒，胞核亦有少量表達(dá)。PTEN在癌組織及癌旁正常組織中均有表達(dá)，但在癌組織中的失表達(dá)率(67.16%)明顯高于正常肺組織(17.07%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Ki67的陽性染色表現(xiàn)為細(xì)胞核著棕黃色，在癌組織中的失表達(dá)率(76.12%)亦明顯高于正常組織(7.31%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，詳見圖1、表1。

2.2 PTEN和Ki67在NSCLC中的表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性

不同性別、年齡組PTEN和Ki67的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);PTEN和Ki67的表達(dá)與組織類型、分化程度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)關(guān)系:隨腫瘤分化程度的升高，PTEN表達(dá)逐漸升高，而Ki67的表達(dá)呈逐漸降低;PTEN陽性表達(dá)與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移率呈負(fù)相關(guān)，而Ki67蛋白表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);PTEN和Ki67的表達(dá)與腫瘤的位置、大小等無關(guān)(P＞0.05)。見表2。

2.3 NSCLC中PTEN表達(dá)與Ki67表達(dá)的相關(guān)性

NSCLC組織中PTEN和Ki67表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r= －0.627，P=0.021)，見表3。

3 討 論

圖1 PTEN在非小細(xì)胞肺癌(腺、鱗癌)中的陽性表達(dá)(A、B)及Ki67在非小細(xì)胞肺癌(腺、鱗癌)中的陽性表達(dá)(C、D) ×200Fig 1 PTEN(in brown)is expressed in cytoplasm of NSCLC A(adenocarcinoma)，B(squamous carcinoma);Ki67(in brown)is expressed in nuclei of NSCLC C(adenocarcinoma)，D(squamous carcinoma) ×200

表1 PTEN和Ki67在NSCLC及癌旁正常肺組織中的表達(dá)例Tab 1 Expression of PTEN and Ki67 in NSCLC and adjacent normal lung tissues case

PTEN是1997年首先被發(fā)現(xiàn)的具有磷酸酯酶活性的抑癌基因，含有1 209個(gè)核苷酸，編碼由403個(gè)氨基酸組成、相對(duì)分子質(zhì)量為47 000、位于細(xì)胞漿的蛋白質(zhì)，即酪氨酸磷酸酯酶［6］。PTEN編碼的磷酸酯酶通過阻斷PI3K/蛋白激酶B通路，使局灶性黏著斑激酶去磷酸化，下調(diào)Ras介導(dǎo)的絲裂酶原激活蛋白激酶活化，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞周期，并對(duì)細(xì)胞增殖、浸潤和遷移等多方面起調(diào)控作用［7-9］。Yoshimoto等［10］對(duì)前列腺癌的研究顯示，PTEN基因在前列腺癌中的突變率為43%。本研究顯示，PTEN在癌旁正常組織中的缺失或低表達(dá)率高于肺癌組織，表明PTEN可能參與了肺癌的發(fā)生，其缺失或低表達(dá)，可能導(dǎo)致肺組織上皮突變和過度增殖，從而形成腫瘤［11］。肺鱗癌PTEN基因的陽性表達(dá)較其他類型低，在不同分化程度的肺癌組織中，PTEN基因的表達(dá)同樣有差異。本研究表明，在肺腺癌、鱗癌、大細(xì)胞癌組織標(biāo)本中，分化程度越低，PTEN基因陽性表達(dá)率越低，低分化組與高、中分化組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示PTEN基因的缺失與腫瘤的分型和惡性分化程度亦具有相關(guān)性。

Ki67是Gerdes等在1983年報(bào)告的一種單克隆抗體，是從L428細(xì)胞系抽取物免疫小鼠過程中獲得的，其基因位于10號(hào)染色體(10q25)上，由分子質(zhì)量為345 kD和395 kD的兩條多肽鏈組成，其抗原是一種與細(xì)胞增殖相關(guān)的核蛋白。研究表明，Ki67表達(dá)主要位于核內(nèi)，其功能與染色質(zhì)相連，可能與細(xì)胞有絲分裂和細(xì)胞周期相關(guān)，能夠反映細(xì)胞的增殖活性［12-15］。因此，本研究試圖通過檢測(cè)Ki67在肺癌組織中表達(dá)，判斷其與腫瘤的惡性生物學(xué)特性的相關(guān)性。結(jié)果顯示:NSCLC與癌旁正常肺組織中均有Ki67增殖抗原表達(dá)，Ki67蛋白在NSCLC組織中的陽性表達(dá)率顯著高于癌旁正常組織，說明Ki67增殖抗原能間接反映惡性腫瘤的無限增殖活性。本組研究中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組Ki67的表達(dá)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組;TNM分期中Ⅲ期的Ki67陽性表達(dá)高于Ⅰ、Ⅱ期;低分化組表達(dá)高于高分化組。Ki67的表達(dá)可能與腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移、臨床分期和分化程度有關(guān)。

表2 PTEN和Ki67在NSCLC中的表達(dá)與臨床病理特征之間的相關(guān)性 例Tab 2 Correlation of expression of PTEN and Ki67 in NSCLC with clinicopathologic features case

表3 NSCLC中PTEN表達(dá)與Ki67表達(dá)的關(guān)系 例Tab 3 Correlation of the expression of PTEN with Ki67 in NSCLC case

此外，本研究也分析了NSCLC組織中PTEN、Ki67表達(dá)的相關(guān)性，表明二者的表達(dá)存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。PTEN表達(dá)水平越低、Ki67表達(dá)越高，則腫瘤組織細(xì)胞增殖越活躍、分化程度越低，患者預(yù)后差。因此，聯(lián)合檢測(cè)PTEN和Ki67對(duì)于判斷NSCLC的惡性程度和預(yù)后具有一定的臨床意義。

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