經(jīng)典H-2分子mRNA探針的制備及在C57小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)原位雜交中的應(yīng)用

劉建娥，沈宇清，李明莉，吳曉箐，史茜，張建瓊

(東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)系，發(fā)育與疾病相關(guān)基因教育部重點(diǎn)實驗室，江蘇南京 210009)

既往認(rèn)為腦部是免疫豁免區(qū)，MHCⅠ類分子僅在病理條件下被誘導(dǎo)表達(dá)［1］。但是隨著檢測技術(shù)的發(fā)展，近年的研究發(fā)現(xiàn)，MHCⅠ類分子在正常的未受感染的神經(jīng)元上也有表達(dá)，同時具有時空特異性和可調(diào)控性，并發(fā)揮了非常重要的作用［2］。但在小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中只在某些時期特定部位發(fā)現(xiàn)有MHCⅠ類分子的表達(dá)［3-6］，不同發(fā)育階段不同部位MHCⅠ類分子的表達(dá)模式未見系統(tǒng)性報道。MHC分子具有高度多態(tài)性，不同物種之間以及相同物種不同品系之間存在著差異［7］，小鼠 MHC 分子稱為 H-2 復(fù)合體［8-9］。H-2復(fù)合體是由彼此獨(dú)立又緊密連鎖的基因座位組成，長約1 500 kb。H-2復(fù)合體基因分為3類，其中Ⅰ類基因因多態(tài)性、產(chǎn)物分布與功能的不同又可分為經(jīng)典與非經(jīng)典兩類基因。H2-D、H2-K和H2-L為H-2復(fù)合體中的經(jīng)典Ⅰ類基因，在C57小鼠中經(jīng)典Ⅰ類基因僅包括H2-D和H2-K，并且143～463 bp為其保守序列，此段DNA序列為合成H-2分子特異性mRNA探針提供了依據(jù)。

本實驗通過合成地高辛標(biāo)記的經(jīng)典H-2 mRNA的特異性探針，利用原位雜交方法觀察經(jīng)典H-2 mRNA在正常發(fā)育的C57小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究經(jīng)典H-2分子在小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中較為精細(xì)的表達(dá)模式和作用機(jī)制及其與非經(jīng)典Ⅰ、Ⅱ類分子表達(dá)的異同奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

C57BL/6小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，質(zhì)粒小量制備采用QIAGEN公司質(zhì)粒小量提取試劑盒，轉(zhuǎn)錄試劑購自Roche公司，PCR擴(kuò)增試劑購自Invitrogen公司，U47325購自O(shè)penbiosystem公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗小鼠與取材 取性成熟的C57BL/6雌雄鼠于16:00后合籠，次日開始每天12:00前檢測雌鼠有無陰道栓，檢出陰道栓的當(dāng)日標(biāo)記為E 0.5 d，小鼠出生當(dāng)日記為P 0。

胚胎鼠腦組織獲得:斷頸處死孕鼠，取出胚胎，在DEPC-PBS中剝除子宮壁和胎膜;將胚胎移入4%DEPC-PFA中，在體視鏡下仔細(xì)分離腦組織。將腦組織置于4%DEPC-PFA，4℃過夜固定;用30%蔗糖(0.1 mol·L－1DEPC-PBS配)4 ℃浸泡至組織塊沉底;用OCT包埋，－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)小鼠經(jīng)典H-2 cDNA基因序列(U47325)，應(yīng)用上游引物5'-NNGTN GGCTA YGTKG ACRAC-3'、下 游 引 物 5'-KYRGG TYYTC RTTCA GGG-3'進(jìn)行PCR產(chǎn)物擴(kuò)增，目的片段長度為321 bp，對應(yīng)于小鼠經(jīng)典H-2核苷酸序列的第143～463位。PCR擴(kuò)增的條件為:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s，61℃退火30 s，72℃延伸40 s，循環(huán)30次;72℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物(321 bp);PCR純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物;通過T4連接酶連接反應(yīng)，將PCR產(chǎn)物與pGEM-T Easy載體連接。1.2.3 正反義探針的制備 將構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)菌中，經(jīng)篩選、提取、純化，再根據(jù)pGEM-T Easy載體的多克隆位點(diǎn)和經(jīng)典H-2本身的酶切位點(diǎn)，選用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和PstⅠ酶切鑒定克隆的質(zhì)粒。經(jīng)測序，插入序列的方向與pGEM-T Easy載體自身DNA的方向相同(圖1)。擴(kuò)增的質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和PstⅠ酶切，使其線性化，再采用T7和Sp6轉(zhuǎn)錄酶，體外轉(zhuǎn)錄合成經(jīng)典H-2 mRNA的正、反義探針。

圖1 pGEM-T Easy載體示意圖(A)、酶切位點(diǎn)(B)及插入序列H-2的位置和方向(C)Fig 1 The sketch map and restriction enzyme cutting site of pGEM-T Easy Vector correspond to A and B.The location and direction of inserted sequence H-2 are shown in C

1.2.4 原位雜交 將在－70℃保存的切片拿到室溫下放置30 min，直至切片回到室溫，再放到50℃雜交爐中烤片烤20 min;DEPC-PBS洗片5 min;4%DEPC的多聚甲醛中前固定20 min，洗片;蛋白酶K緩沖液處理組織切片，洗片;后固定30 min;置于新配制的TEA緩沖液洗10 min;將切片浸在預(yù)雜交液中放入63～65℃的雜交爐中預(yù)雜交3～4 h;制備濕盒(干的雜交盒底部加用過的預(yù)雜交液)，將含0.008 μg·(100 μl)－1探針的雜交液加在切片上;放入65℃的雜交爐中雜交12～16 h;65℃，在預(yù)熱的0.2 mol·L－1SSC中洗掉蓋玻片(勿搖);用 PBT洗 2次，每次20 min;10%的血清(PBT稀釋)封閉30 min;倒去切片上的血清，勿洗，加含1∶2 000的抗地高辛抗體的血清，3 h;PBT洗6次，每次10 min;堿性磷酸酶緩沖液洗2次，每次5 min;加顯色液，避光，顯色;PBS終止顯色反應(yīng);4%多聚甲醛后固定1～2 h;PBS漂洗，甘油封片劑封片，室溫保存。

2 結(jié) 果

2.1 正反義探針的制備

見圖2。

圖2 經(jīng)典H-2基因片段PCR電泳圖 1、2.PCR擴(kuò)增的針對經(jīng)典H-2的特異性片段;3.經(jīng)典H-2插入pGEM-T Easy載體的目的片段雙酶切鑒定圖;4.Marker DL 2 000Fig 2 The PCR products of classical H-2 gene were examined by standard agarose gel electrophoresis

通過合成引物，PCR擴(kuò)增出經(jīng)典H-2的特異性片段，其產(chǎn)物大小為321 bp。圖2中1、2泳道為經(jīng)典H-2 PCR產(chǎn)物的電泳圖。然后將PCR產(chǎn)物純化后，與pGEM-T Easy載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α中，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。3泳道為質(zhì)粒經(jīng)內(nèi)切酶NcoⅠ和PstⅠ雙酶切鑒定圖，可見目的片段大小為321 bp，即為所需片段的大小。

2.2 測序結(jié)果

見圖3。

經(jīng)過測序，目的片段321 bp與經(jīng)典H-2分子序列(143～463 bp)堿基完全相同，沒有突變，即可運(yùn)用此菌液克隆擴(kuò)增，提取質(zhì)粒線性化進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，采用T7和Sp6轉(zhuǎn)錄酶，分別合成經(jīng)典H-2 mRNA的正、反義探針。

2.3 原位雜交

見圖4。

所合成的經(jīng)典H-2探針運(yùn)用原位雜交方法鑒定其特異性的可行性。圖4反義探針結(jié)果顯示的是經(jīng)典H-2在C57小鼠P15小腦中的表達(dá)情況。同時運(yùn)用正義探針對相同部位進(jìn)行雜交，無雜交信號，作為陰性對照。由此可見，合成的經(jīng)典的H-2 mRNA探針可以特異性地結(jié)合組織中的mRNA，可用于原位雜交檢測其在C57小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)模式。

3 討 論

MHC分子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)是否表達(dá)曾有爭議，既往沒有在中樞神經(jīng)系統(tǒng)檢測到MHCⅠ類分子的表達(dá)可能是由于以下原因:首先，腦切片組織的固定方法對抗體識別抗原表位的影響，使得抗體的靈敏度下降［10］。其次可能是因為在小鼠不同發(fā)育階段有不同的MHCⅠ類分子的表達(dá)，所以研究不同發(fā)育時期MHCⅠ類分子的表達(dá)對抗體的需求不同［3-4］。因而免疫組化方法用于檢測MHCⅠ類分子蛋白水平的表達(dá)受到一定的限制，同時蛋白水平和轉(zhuǎn)錄水平也會出現(xiàn)一定的差異表達(dá)。因此選用原位雜交的方法來檢查MHCⅠ類分子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)也是十分必要的。

MHC是一組緊密連鎖的基因群，經(jīng)典MHCⅠ類基因區(qū)具有高度多態(tài)性，這對合成經(jīng)典Ⅰ類基因的特異性探針提出了很高的要求，所合成的探針必須是針對其堿基序列中的保守片段，這樣才能保證合成的探針是特異的而具有探索價值。在合成正反義探針的時候，所選擇的轉(zhuǎn)錄片段必須是同一段片段，不能是轉(zhuǎn)錄的不同的片段，這樣就構(gòu)不成所謂的正反義探針［11］。

已有證據(jù)初步推測MHCⅠ類分子不僅發(fā)揮免疫功能，它對正常腦的發(fā)育、神經(jīng)元的分化、突觸可塑性及記憶行為都具有重要的作用［12-14］。MHCⅠ類分子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)及功能的研究是近年的研究熱點(diǎn)，但該高度多態(tài)性的分子在小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)不同時期的表達(dá)模式未見系統(tǒng)性報道，其功能的研究處于起步階段［15-18］。本實驗采用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建重組質(zhì)粒合成了地高辛標(biāo)記的經(jīng)典H-2 mRNA正、反義原位雜交探針，所得到的反義探針作為雜交檢測探針，而正義探針則作為實驗的陰性對照。通過原位雜交，結(jié)果顯示，C57小鼠在P15小腦反義探針呈現(xiàn)陽性結(jié)果，即經(jīng)典H-2 mRNA在P15的小腦有表達(dá)，正義探針對相同部位進(jìn)行雜交則無雜交信號，進(jìn)一步證實了所合成的經(jīng)典H-2 mRNA探針的特異性，這為我們研究經(jīng)典H-2 mRNA在C57小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)譜奠定了基礎(chǔ)。同時運(yùn)用此方法可以進(jìn)一步合成非經(jīng)典H-2Ⅰ類和H-2Ⅱ類基因的特異性探針，比較H-2基因在小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)模式差異。

圖3 經(jīng)典H-2基因片段測序圖——插入的經(jīng)典H-2 cDNA與C57小鼠經(jīng)典H-2基因序列測序峰圖Fig 3 The sequence of classical H-2:the inserted sequence of classical H-2 cDNA and the sequence of classical H-2 in C57 mice

本研究結(jié)果顯示，我們已經(jīng)成功構(gòu)建了特異性的經(jīng)典H-2 mRNA正、反義探針，為研究H-2分子其他成員在小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

圖4 經(jīng)典H-2在C57小鼠P15小腦的表達(dá) A、B(A圖中黑框的放大).經(jīng)典H-2反義探針雜交信號;C.經(jīng)典H-2正義探針雜交信號;Bar:A為450 μm，B、C為150 μm;PK為浦肯野細(xì)胞層(Purkinje cell layer);GL為顆粒層(granula layer)Fig 4 Expression of classical H-2 in the cerebellum of P15 in C57 mice

［1］ LAMPSON L A.Interpreting MHC classⅠ expression and classⅠ/classⅡ reciprocity in the CNS:reconciling divergent findings［J］.Microsc Res Techniq，1995，32:267-285.

［2］NEUMANN H，SCHMIDT H，CAVALIE A，et al.Major histocompatibility complex(MHC)classⅠgene expression in single neurons of the central nervous system:differential regulation by interferon(IFN)-γ and tumor necrosis factor(TNF)-α［J］.Exp Med，1997，185:305-316.

［3］CORRIVEAU R A，HUH G S，SHATZ C J，et al.Regulation of classⅠMHC gene expression in the developing and mature CNS by neural activity［J］.Neuron，1998，21:505-520.

［4］GENE S H，LISA M B，DU H P，et al.Functional requirement for classⅠ MHC in CNS development and plasticity［J］.Science，2000，290:2155-2159.

［5］GODDARD C A，BUTTS D A，SHATZ C J，et al.Regulation of CNS synapses by neuronal MHC classⅠ［J］.PNAS，2007，104:6828-6833.

［6］MASATO O，HIDETOSHI I，JERZY K K，et al.Major histocompatibility complex(MHC)classⅠb gene duplications，organization and expression patterns in mouse strain C57BL/6［J］.BMC Genomics，2008，9:178.

［7］謝維.MHC基因多態(tài)性和腫瘤的發(fā)生［J］.現(xiàn)代免疫學(xué)，2004，24(6):441-444.

［8］KLEIN J.Seeds of time:fifty years ago Peter A.Gorer discovered the H-2 complex［J］.Immunogenetics，1986，24:331-338.

［9］SNELL G D.Some recollections of Peter Gorer and his work on this fiftieth anniversary of his discovery of H-2［J］.Immunogenetics，1986，24:339-340.

［10］RALL G F，MUCKE L，OLDSTONE M B，et al.Consequences of cytotoxic T lymphocyte interaction with major histocompatibility complex class Ⅰ-expressing neurons in vivo［J］.Exp Med，1995，182:1201-1212.

［11］顧香芳，甘光明，王芳，等.應(yīng)用原位雜交技術(shù)分析ZNF216基因在成年小鼠各主要組織中的表達(dá)模式［J］.東南大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2005，24(1):1-4.

［12］SHATZ C J.MHC classⅠ:an unexpected role in neuronal plasticity［J］.Neuron，2009，64:40-45.

［13］MCCONNELL M J，HUANG Y H，DATWANI A，et al.H2-Kb and H2-Db regulate cerebellar long-term depression and limit motor learning［J］.Science，2009，106:6784-6789.

［14］BOULANGER L M.Immune proteins in brain development and synaptic plasticity［J］.Neuron，2009，64:93-109.

［15］ADELSON J D，BARRETO G E，XU L J，et al.Neuroprotection from stroke in the absence of MHC Ⅰ or Pir B［J］.Neuron，2012，73:1100-1107.

［16］ZHONGQI P W，TINA B，NATHALIE E B，et al.Major histocompatibility complex classⅠ-mediated inhibition of neurite outgrowth from peripheral nerves［J］.Immunology Letters，2011，135:118-123.

［17］ZHONGQI P W，LORRAINE W，TINA V B，et al.Enhanced neuronal expression of major histocompatibility complex classⅠleads to aberrations in neurodevelopment and neurorepair［J］.J Neuroimmunol，2011，232:8-16.

［18］DENG X H，AI W M，LEI D L，et al.Lipopolysaccharide induces paired immunoglobulin-like receptor B(PirB)expression，synaptic alteration，and learning-memory deficit in rats［J］.Neuroscience，2012，209:161-170.