烏司他丁對(duì)重度膿毒癥誘導(dǎo)的ALI／ARDS模型大鼠肺組織中蛋白C及活化蛋白C含量的影響

楊春輝 王璐 李虎 薛楊勇 謝娟 徐丹 黃力鷗 吳春榮 唐建國(guó)

（復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院危重癥醫(yī)學(xué)科，上海 200240）

近年來(lái)，有研究［1］認(rèn)為，重度膿毒癥由炎性反應(yīng)、微血管內(nèi)血栓形成和內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)以及它們之間的交互作用所致，它是導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征（MODS）的主要原因之一。急性肺損傷（ALI）和急性呼吸窘迫征（ARDS）是重度膿毒癥誘導(dǎo)的MODS在肺的表現(xiàn)。凝血調(diào)控被認(rèn)為是治療重度膿毒癥新的希望。蛋白C（protein C，PC）及其活化產(chǎn)物活化蛋白C（activated protein C，APC）系統(tǒng)在抗炎性反應(yīng)、抗凝、增加纖溶等方面發(fā)揮重要作用［2］。烏司他丁是從健康男性尿液中分離純化的糖蛋白，是一種廣譜酶抑制劑，對(duì)多種酶、糖和脂水解酶有抑制作用；同時(shí)也是體內(nèi)某些中心蛋白酶的激活劑；此外，烏司他丁對(duì)缺血、缺氧具有調(diào)控作用，可以抑制炎性介質(zhì)的大量釋放和清除自由基。烏司他丁用于重度膿毒癥的治療已有較多報(bào)告，但相關(guān)研究主要集中在烏司他丁的抗炎作用上［3］。目前關(guān)于烏司他丁對(duì)重度膿毒癥誘導(dǎo)的ALI／ARDS肺組織PC及APC含量的影響鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究應(yīng)用盲腸結(jié)扎穿孔（cecal ligation and puncture，CLP）法聯(lián)合0.9%氯化鈉溶液灌洗法制作重度膿毒癥誘導(dǎo)的ALI／ARDS大鼠模型，研究烏司他丁對(duì)該模型大鼠肺組織PC及APC含量的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 27只清潔級(jí)雄性SD大鼠（復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），體質(zhì)量200～250 g。按照隨機(jī)數(shù)字法將其分為對(duì)照組、烏司他丁5萬(wàn)U／kg組、烏司他丁10萬(wàn)U／kg組，每組9只，觀察時(shí)間點(diǎn)為造模后1、2、3 h。

1.1.2 材料 烏司他?。◤V東天普生化醫(yī)藥股份有限公司）；PC酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）；APC ELISA試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）；TKR－200C小動(dòng)物呼吸機(jī)（江西特立麻醉有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 ALI／ARDS大鼠模型制作 采用 CLP法制作膿毒癥大鼠模型。麻醉SD大鼠后，無(wú)菌條件下取腹部正中切口開(kāi)腹，將盲腸移出腹腔，結(jié)扎盲腸根部，在盲腸游離端選2個(gè)相距3 cm的點(diǎn)，用9號(hào)注射針頭分別刺孔穿通盲腸，將盲腸復(fù)位，縫合腹部切口，置大鼠于籠內(nèi)活動(dòng)，不禁飲食［4］。CLP后6～12 h發(fā)生由全身炎性反應(yīng)導(dǎo)致的器官功能障礙。本實(shí)驗(yàn)采用CLP后16 h作為膿毒癥大鼠接受二次打擊進(jìn)入重度膿毒癥誘導(dǎo)ALI／ARDS的時(shí)間點(diǎn)［5］。大鼠CLP后16 h予氣管切開(kāi)，給予38℃0.9%氯化鈉2 mL灌洗肺泡，以PaO2／FiO2≤300作為ALI／ARDS大鼠建模成功標(biāo)準(zhǔn)。各組均在造模成功后立即予烏司他丁或0.9%氯化鈉溶液靜脈注射，烏司他丁5萬(wàn)U／kg組予烏司他丁5萬(wàn)U／kg靜脈注射，烏司他丁10萬(wàn)U／kg組予烏司他丁10萬(wàn)U／kg靜脈注射，對(duì)照組予0.9%氯化鈉溶液靜脈注射，注射持續(xù)時(shí)間均為10 min。各組接呼吸機(jī)輔助呼吸，吸氧濃度100%，呼吸頻率90次／min，潮氣量1 mL。

1.2.2 肺組織標(biāo)本制備 各組造模后1、2、3 h處死大鼠，稱取單位質(zhì)量（1mg）肺組織，加入單位體積0.9%氯化鈉溶液（1 mL）后碾碎，離心（3000 r／min）10 min后，取上清液100μl，保存于－20℃中。

1.2.3 PC及APC含量的檢測(cè)按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組ALI／ARDS模型大鼠肺組織PC的含量見(jiàn)表1。

表1 烏司他丁對(duì)ALI／ARDS模型大鼠肺組織PC含量（ng／mL）的影響（）

表1 烏司他丁對(duì)ALI／ARDS模型大鼠肺組織PC含量（ng／mL）的影響（）

注：與對(duì)照組比較，＊＊P＜0.01

2.2 各組ALI／ARDS模型大鼠肺組織APC的含量 見(jiàn)表2。

表2 烏司他丁對(duì)ALI／ARDS模型大鼠肺組織APC含量（ng／mL）的影響（）

表2 烏司他丁對(duì)ALI／ARDS模型大鼠肺組織APC含量（ng／mL）的影響（）

注：與對(duì)照組比較，＊P＜0.05

組別 1 h 2 h 3h對(duì)照組1459±3951300±3481141±318烏司他丁5萬(wàn)U／Kg組 1596±516＊ 1994±196＊ 1712±456＊烏司他丁10萬(wàn)U／Kg組 2798±380＊ 2964±731＊ 3156±805＊

3 討 論

炎性反應(yīng)、凝血功能紊亂及兩者間的交叉作用在重度膿毒癥發(fā)病中起重要作用。肺是重度膿毒癥誘發(fā) MODS時(shí)首先累及的器官，表現(xiàn)為 ALI／ARDS。凝血功能紊亂和纖溶失調(diào)也是ALI／ARDS發(fā)展的重要機(jī)理之一。

重度膿毒癥患者的機(jī)體對(duì)凝血功能和炎性反應(yīng)的調(diào)控部分是通過(guò)激活凝血酶和PC系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的。重度膿毒癥患者血漿中PC表達(dá)下調(diào)可能會(huì)導(dǎo)致膿毒癥患者血管內(nèi)皮功能缺陷，PC水平降低與死亡風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)［6］。本研究顯示，烏司他丁5萬(wàn)U／kg組與對(duì)照組相比，PC水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但烏司他丁10萬(wàn)U／kg組PC的含量明顯高于烏司他丁5萬(wàn)U／kg組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)果提示，烏司他丁使肺組織蛋白PC含量升高，該作用與劑量呈正相關(guān)，可能與烏司他丁具有功能臟器保護(hù)有關(guān)［7］，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

PC在絲氨酸蛋白酶的作用下激活形成APC，APC可能特異性抑制微血管血栓的形成，促進(jìn)纖維蛋白降解［8］。APC在PC受體和可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白（thrombomodulin，TM）／凝血酶受體（thrombin receptor，TR）的結(jié)合下，可以直接抑制凝血因子Ⅴa和Ⅷa，減少凝血酶的產(chǎn)生，減少纖溶液原激活物抑制物－1（PAI－1），從而增強(qiáng)纖溶［9］。盡管對(duì)于外源性重組人活化蛋白C（recombinant human activated protein C，rhAPC）是否能使重度膿毒癥患者獲益仍有爭(zhēng)議［10］，內(nèi)源性的PC及APC對(duì)抗凝、抗感染和增加纖溶的作用仍十分重要［1－2］。有研究［11］發(fā)現(xiàn)，烏司他丁可以抑制纖溶系統(tǒng)的激活，可減輕肺缺血－再灌注損傷模型大鼠全身炎性反應(yīng)，能有效抑制油酸介導(dǎo)的急性肺損傷，改善氧合。本研究顯示，烏司他丁10萬(wàn)U／kg組與烏司他丁5萬(wàn)U／kg組APC的含量明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各組APC的含量組內(nèi)比較差異雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但對(duì)照組APC的含量隨時(shí)間延長(zhǎng)呈進(jìn)行性下降趨勢(shì)，與相關(guān)研究［12］吻合，而兩個(gè)不同劑量烏司他丁組APC含量卻表現(xiàn)為逐步上升，提示烏司他丁可能通過(guò)升高APC的含量對(duì)膿毒癥誘導(dǎo)的ALI／ARDS大鼠肺呈保護(hù)作用，其機(jī)制可能與烏司他丁抑制炎性反應(yīng)途徑引起的高凝狀態(tài)、減少APC的消耗、具有廣泛的酶活性抑制作用、抑制炎性介質(zhì)的釋放及對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)等因素相關(guān)。

目前烏司他丁已應(yīng)用于重度膿毒癥的臨床治療，且取得了一定的療效。本研究顯示，烏司他丁使重度膿毒癥誘導(dǎo)的ALI／ARDS模型大鼠肺組織的PC和APC含量升高，呈劑量依賴趨勢(shì)，對(duì)ALI／ADRS大鼠肺組織呈保護(hù)作用。

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