引起仔豬關(guān)節(jié)腫大的傳染性病原檢測(cè)分析

儲(chǔ)玉雙,黃小紅,胡善輝,蔡艷,萬(wàn)培偉

（江西生物科技職業(yè)學(xué)院，江西 南昌 330200）

在規(guī)?；i場(chǎng)，多發(fā)性關(guān)節(jié)炎引起的仔豬關(guān)節(jié)腫大越來越多。引起關(guān)節(jié)腫脹的主要病原菌有豬鏈球菌、豬丹毒桿菌、衣原體病、豬葡萄球菌、棒狀桿菌屬、副豬嗜血桿菌、大腸桿菌、放線菌、豬鼻支原體等[1，2]。2008年吳峙宏、石超軍[3]對(duì)某豬場(chǎng)流行的一種以腿部關(guān)節(jié)腫大為特征的慢性疾病，進(jìn)行了細(xì)菌的分離純化、形態(tài)和培養(yǎng)特性觀察以及生化測(cè)定應(yīng)用PCR 對(duì)9株可疑病株進(jìn)行了檢測(cè)，均能擴(kuò)增出預(yù)期大小的特異性片段，綜合細(xì)菌的培養(yǎng)特性和染色鏡檢以及生化實(shí)驗(yàn)可以確定此豬場(chǎng)仔豬關(guān)節(jié)炎的病原為鏈球菌。1997年，孫裕光、沙莎[4]從診治的15頭患病豬中選擇了關(guān)節(jié)炎病情嚴(yán)重的3頭豬做了病理學(xué)及細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn),證明該病的病原為多殺性巴氏桿菌。1999年張耀相、梁榮等[5]從某豬場(chǎng)發(fā)生一種以膿性、干酪性關(guān)節(jié)炎為特征的病例中，分離到數(shù)株G+棒狀細(xì)菌，鑒定為化膿放線菌，曾稱為化膿棒狀桿菌。這些細(xì)菌侵害豬的蹄部、腕部、肘部關(guān)節(jié)等，在局部引起紅、腫、熱、痛，導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎，從而引發(fā)四肢運(yùn)動(dòng)機(jī)能障礙。其中細(xì)菌引起的仔豬關(guān)節(jié)腫大已成為許多豬場(chǎng)的嚴(yán)重問題之一，給豬場(chǎng)的生產(chǎn)造成較大的損失，表現(xiàn)為生長(zhǎng)速度減慢，飼料轉(zhuǎn)化率降低，某些情況下甚至可能引起死亡。

近年來，由于豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）和豬圓環(huán)病毒Ⅱ型（PCV2）的廣泛流行[6]，造成豬群出現(xiàn)免疫抑制，仔豬關(guān)節(jié)腫大的感染和發(fā)病率升高。仔豬關(guān)節(jié)炎的發(fā)病有呈單一感染，大部分與其他細(xì)菌呈混合感染，也有引起繼發(fā)感染的報(bào)道。葉清超[7]報(bào)道了福建平和縣小溪鎮(zhèn)某養(yǎng)豬場(chǎng)在2006年10月發(fā)生了一起以急性、熱性、出血性并伴有關(guān)節(jié)腫脹、腦膜炎和敗血癥為特征的急性傳染病，應(yīng)用多種抗生素治療無效。根據(jù)流行病學(xué)、臨床癥狀觀察、病理剖檢變化、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果，確診為豬瘟繼發(fā)豬鏈球菌病。

仔豬關(guān)節(jié)腫大因妨礙養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展和造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失而逐漸引起養(yǎng)豬業(yè)者的重視，但因?qū)ζ浒l(fā)生原因等缺乏認(rèn)識(shí)，從而在防治措施上無所適從。此文通過對(duì)關(guān)節(jié)液中病原的分離、培養(yǎng)、生化鑒定以及藥物敏感試驗(yàn)來分析病原，并歸納出對(duì)細(xì)菌性病原敏感的藥物種類，對(duì)治療該類疾病提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 病料來源

江西新建縣、樟樹市、進(jìn)賢縣、高安市、南昌縣等多個(gè)地區(qū)現(xiàn)場(chǎng)采集的關(guān)節(jié)液及送檢仔豬關(guān)節(jié)腫脹的50份病料，一經(jīng)送到，立即進(jìn)行病原的分離培養(yǎng)。

1.2 主要培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、巧克力瓊脂培養(yǎng)基、血液瓊脂培養(yǎng)基、TSA 固體培養(yǎng)基（胰蛋白大豆瓊脂）、TSB 液體培養(yǎng)基(胰蛋白大豆肉湯)、麥康凱培養(yǎng)基。

1.3 主要試劑

V 因子（NAD 煙酰胺腺嘌吟二核苷酸），上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；無菌胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司；藥敏紙片，生化微量鑒定管，杭州天和微生物試劑有限公司；TSA、TSB，Difco公司；革蘭氏染色液、芽孢染色液及其他分析純，本試驗(yàn)室提供。

1.4 主要儀器設(shè)備

培養(yǎng)箱、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、高壓滅菌器、超凈工作臺(tái)、電子顯微鏡、冰箱、自動(dòng)雙蒸水蒸餾器、電子天平、接種棒、燭缸、無菌培養(yǎng)皿、鑷子、酒精燈、托盤、電子萬(wàn)用爐、直尺等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 關(guān)節(jié)液的采取

2.1.1 送檢關(guān)節(jié)液的采取。在超凈工作臺(tái)的紫外燈打開照射20～30min 后，關(guān)掉紫外燈。將病料放入托盤中，用鑷子夾住一個(gè)酒精棉球，擦拭豬關(guān)節(jié)周邊的污染物，丟棄。再取一個(gè)酒精棉球，在酒精燈點(diǎn)燃，對(duì)準(zhǔn)豬腕關(guān)節(jié)或跗關(guān)節(jié)上下轉(zhuǎn)動(dòng)灼燒至豬毛褪去。10mL 的一次性注射器插入關(guān)節(jié)的凹處，抽取關(guān)節(jié)液。得到的關(guān)節(jié)液保存在4℃的冰箱內(nèi)，待用。

2.1.2 活體豬關(guān)節(jié)液的采取。到豬場(chǎng)采取活體豬關(guān)節(jié)液時(shí)，由飼養(yǎng)員幫忙固定，在注射點(diǎn)周邊用高錳酸鉀液沖洗，再用酒精棉球擦拭，應(yīng)用一次性注射器抽取關(guān)節(jié)液。得到的關(guān)節(jié)液放入裝有冰袋的塑料箱內(nèi)，在7h內(nèi)帶入試驗(yàn)室進(jìn)行病原分離培養(yǎng)。

2.2 病原菌分離

在無菌操作條件下在采取的關(guān)節(jié)液一滴于TSA培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或巧克力瓊脂培養(yǎng)基中，劃線接種，37℃培養(yǎng)24～48h，觀察菌落形態(tài)，然后挑取可疑單菌落，轉(zhuǎn)接相同的培養(yǎng)基進(jìn)行純培養(yǎng)。

2.3 涂片染色鏡檢

2.4 生化鑒定

在無菌操作臺(tái)上，用接種環(huán)分別挑取純培養(yǎng)的單菌落于（葡萄糖、木糖、果糖、阿拉伯糖、山梨醇、甘露糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、半乳糖、尿素、棉子糖、血清菊糖)等微型生化鑒定管，將分離的 A、B、C、D、E、F菌同時(shí)加入0.01%的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）5μL，置于37℃0.5%的CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 小時(shí)，觀察結(jié)果。再將 A、B、C、D、E、F 菌不加入 0.01% 的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）37℃培養(yǎng)24 h 后，觀察其對(duì)糖的利用情況。

2.5 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)根據(jù)美國(guó)臨床標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì) (NCCLS)推薦的K－B 瓊脂法進(jìn)行。試驗(yàn)所選擇藥物一般包括下列抗生素：氨芐西林(AMP)，頭孢曲松(CRO)，慶大霉素(GM)，萬(wàn)古霉素(VA)，環(huán)丙沙星(CIP)，諾氟沙星(NOR)，四環(huán)素(TBT)，乙酰螺旋霉素(ASP)，等。藥敏結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)按照NCCLS 手冊(cè)2005 版[8]。

3 結(jié)果與分析

3.1 關(guān)節(jié)變化

關(guān)節(jié)腫大變形，注射器抽取的關(guān)節(jié)液可見有淡黃色粘液，個(gè)別嚴(yán)重者有膿性較粘稠分泌液。

3.2 細(xì)菌分離結(jié)果

A、分離到在普通瓊脂平板或TSA 平板上37℃孵育24～48h 后可形成金黃色的1～2mm 的圓形、凸起、光滑、濕潤(rùn)、不透明的菌落32份。

B、分離到在TSA 培養(yǎng)基上37℃孵育24～48h 后形成菌落細(xì)小，直徑0.5～1mm 的透明、發(fā)亮、光滑、圓形、邊緣整齊的菌落，在血瓊脂平板中37℃培養(yǎng)24h后，形成灰白色、圓形、透明、閃光、中央隆起、表面光滑的露珠狀小菌落9株，其中溶血的2株，不溶于血的有7份。

C、在TSA（加入了牛血清和NAD）培養(yǎng)基中37℃孵育48～72h 后觀察到針尖大小、無色透明、光滑濕潤(rùn)的露珠樣菌落1份。

D、在血瓊脂平板37℃培養(yǎng)24h～48h 后，形成細(xì)小露滴樣菌落，并形成明顯的β型溶血的菌落8份。

E、在血清瓊脂平板上37℃培養(yǎng)24h，可長(zhǎng)成淡灰白色、邊緣整齊、表面光滑、閃光的露珠狀小菌落。在血瓊脂平板上，長(zhǎng)成水滴樣小菌落，形成明顯的β型溶血3份。

F、在TSA（加入了牛血清和NAD）培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng) 24h～48h，形成圓形、凸起、光滑、濕潤(rùn)、不透明偏黃色長(zhǎng)成一片的8份。

細(xì)菌分離結(jié)果顯示A 菌分離到的菌落很多，而B、D、F 菌相對(duì)較少，E 菌和C 菌很難分離得到，一方面可能由于細(xì)菌的培養(yǎng)條件的限制，另一方面細(xì)菌定居致病不同，當(dāng)然與豬場(chǎng)先前的預(yù)防免疫防治存在很大的關(guān)系。在50份病料關(guān)節(jié)液中，分離培養(yǎng)時(shí)未生長(zhǎng)細(xì)菌的有20份。

3.3 涂片鏡檢結(jié)果（見表1）

通過病原的分離培養(yǎng)及涂片鏡檢的結(jié)果，初步懷疑A 是葡萄球菌，B 是鏈球菌，C 副豬嗜血桿菌，D 是化膿棒狀桿菌，E 是多殺性巴氏桿菌，F(xiàn) 是芽孢桿菌。

表1 仔豬關(guān)節(jié)腫大分離菌的涂片鏡檢結(jié)果

3.4 生化鑒定結(jié)果(見表2)

表2 疑似菌株生化鑒定結(jié)果

3.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

各疑似菌株及仔豬關(guān)節(jié)液的藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)菌抑菌圈直徑見表3。

與CLSI 操作手冊(cè)進(jìn)行比對(duì)，得出細(xì)菌A、B、C、D、E 及關(guān)節(jié)液對(duì)15種抗菌藥物的敏感程度結(jié)果如下：

A 菌株對(duì)卡那霉素、頭孢唑啉、頭孢曲松高敏，對(duì)青霉素、慶大霉素、乙酰螺旋霉素中敏，對(duì)四環(huán)素、氯霉素、鏈霉素、諾氟沙星不敏感。

B 菌株對(duì)氨芐西林、頭孢唑啉、頭孢曲松、乙酰螺旋霉素高度敏感，對(duì)慶大霉素、卡那霉素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、青霉素中度敏感，對(duì)鏈霉素、四環(huán)素、氯霉素不敏感。

C 菌株對(duì)頭孢曲松、頭孢唑啉、諾氟沙星、萬(wàn)古霉素、環(huán)丙沙星高敏；對(duì)卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素中敏；對(duì)鏈霉素、氨芐西林低敏；對(duì)青霉素、慶大霉素不敏感（NS）。

D 菌株對(duì)卡那霉素、新生霉素、諾氟沙星、呋喃妥因、頭孢唑啉高度敏感；對(duì)四環(huán)素、氯霉素中度敏感；對(duì)青霉素、慶大霉素、鏈霉素不敏感。

E 菌對(duì)慶大霉素、青霉素、鏈霉素、環(huán)丙沙星、氨芐西林、頭孢唑啉、頭孢曲松高等高度敏感；對(duì)卡那霉素、氯霉素的敏感性很低，對(duì)萬(wàn)古霉素、乙酰螺旋霉素、呋喃妥因不敏感。

關(guān)節(jié)液分離菌對(duì)慶大霉素、萬(wàn)古霉素、氯霉素、卡那霉素、呋喃妥因、乙酰螺旋霉素敏感；對(duì)頭孢唑啉、新生霉素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星中敏；對(duì)氨芐西林、青霉素、四環(huán)素低敏；對(duì)鏈霉素不敏感。

表3 疑似菌株生化鑒定結(jié)果 mm

4 討論

4.1 關(guān)節(jié)液的采集

病料采集前，要了解病豬是否用藥，用了哪些藥，近期是否進(jìn)行過免疫接種，為以后分離菌的藥敏試驗(yàn)及防治提供參考依據(jù)。但因?yàn)榇蟛糠质撬蜋z的病料，未了解到相關(guān)的情況。無論是去豬場(chǎng)采集還是送檢的病料，病變關(guān)節(jié)液的采集過程中都要特別注意到無菌污染的要求，因?yàn)榭諝庵械牟≡约柏i關(guān)節(jié)表面的污染菌都會(huì)影響試驗(yàn)的細(xì)菌分離結(jié)果。

病料在采集、保存和運(yùn)輸時(shí)，采取病料應(yīng)在動(dòng)物死后立即進(jìn)行，夏季不能超過6h，否則尸體腐敗或腸道內(nèi)的細(xì)菌侵入內(nèi)臟而造成污染，影響檢驗(yàn)結(jié)果。病變關(guān)節(jié)液用滅菌注射器抽取膿腫之膿汁，置于滅菌EP 管中。對(duì)較粘稠的膿汁，可向膿腫內(nèi)注入1～2mL滅菌生理鹽水，然后再吸取。副豬嗜血桿菌通常在死亡病例難以分離到，常采取發(fā)病典型病例人工致死的方法，取新鮮病料，又由于其非常嬌嫩，從選取病料到送檢一般不超過12h，否則難以分離得到。剛采集到的病變關(guān)節(jié)液要放入4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

4.2 病原的分離

導(dǎo)致仔豬關(guān)節(jié)腫大的不止一種病原菌，常常一份關(guān)節(jié)液中會(huì)分離到幾種不同的菌株。所以對(duì)這些菌株哪些是致病菌，哪些是病變關(guān)節(jié)液中的常在定居菌；關(guān)節(jié)腫大是由其他疾病繼發(fā)或幾種疾病混發(fā)等問題很難判斷。

也有未見菌落生長(zhǎng)的情況（夏冬季居多，春秋季較少）。從初步鑒定到進(jìn)一步選擇培養(yǎng)基進(jìn)行的純培養(yǎng)、分離鑒定都要及時(shí)、準(zhǔn)確，當(dāng)天的事當(dāng)天完成。葡萄球菌在普通瓊脂培養(yǎng)基上即可生長(zhǎng)，很容易分離到；鏈球菌、化膿棒狀桿菌等在血瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察溶血性，分離情況受臨床用藥及疾病的嚴(yán)重程度而定，癥狀較輕微，病原微生物的定居及量的多少，都對(duì)病原分離有重大影響。HPS 在病料中十分嬌嫩，因此用于細(xì)菌分離的病料的選取要選擇典型病例的病變器官，而關(guān)節(jié)液分離到副豬嗜血桿菌的報(bào)道很少，常見是在豬鼻腔、漿膜表面物質(zhì)或滲出液、心包等組織器官采樣分離到。本試驗(yàn)唯一分離到的一株也是在發(fā)生該疾病同窩的急性發(fā)病期，關(guān)節(jié)腫脹、跛行非常嚴(yán)重，且有發(fā)病死亡病例的情況下，采集活體豬關(guān)節(jié)液分離得到。

4.3 生化鑒定

為了達(dá)到特異性的鑒別病原菌，不同菌的生化鑒定采用不同的鑒定條件，這就要求在初步分離培養(yǎng)、涂片鏡檢的基礎(chǔ)上鎖定病原菌的范圍，進(jìn)一步按照細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)的生化鑒定項(xiàng)進(jìn)行檢驗(yàn)。其中，副豬嗜血桿菌生化鑒定需同時(shí)加入5μL 0.01%的NAD，滿足菌株生長(zhǎng)的需要。細(xì)菌生化鑒定結(jié)果大部分與鑒定手冊(cè)相同，幾項(xiàng)結(jié)果不一致可能是因?yàn)椴僮鞑划?dāng)，未接種到相應(yīng)的菌落，出現(xiàn)陰性的結(jié)果或生化鑒定管的顏色無變化等。

4.4 藥物敏感試驗(yàn)

通過對(duì)各個(gè)病菌及關(guān)節(jié)液的耐藥性分析，發(fā)現(xiàn)之間存在很大差異，各個(gè)病菌存在差異是確定，但總的關(guān)節(jié)液的抑菌圈直徑存在很大差異，每次的結(jié)果不一樣，這與抗菌藥物使用頻率的增加，耐藥譜越來越寬，各個(gè)地方的發(fā)病和用藥情況的不一樣，藥敏試驗(yàn)也有所差異[9]。在總的關(guān)節(jié)液的藥敏試驗(yàn)中，有對(duì)全部病菌都有抑制作用的藥物，如頭孢唑啉；有對(duì)其中一種或幾種病菌有耐藥性，抑菌圈的直徑有大有小，如環(huán)丙沙星、四環(huán)素等；也有完全沒有抑菌作用的藥物，如鏈霉素，抑菌圈直徑為0mm。對(duì)于臨床混合發(fā)病及繼發(fā)的病例的治療提供了參考。

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