Lotus japonicus共生固氮基因的比較基因組學(xué)

黃世棟，冀洪芳，聶旋，成婷婷，楊艷梅，王金鵬

(河北聯(lián)合大學(xué)理學(xué)院，河北唐山 063009)

0 引言

生物固氮(Biological nitrogen fixation)是固氮微生物特有的一種生理功能，這種功能是在固氮酶的催化作用下進(jìn)行的。固氮酶是一種能夠?qū)⒎肿拥€原成氨的酶。近20年來生物固氮已經(jīng)成為一個(gè)多學(xué)科的綜合性研究項(xiàng)目，分別在分子、細(xì)胞、個(gè)體和生態(tài)等多層次水平上，從微觀到宏觀不斷地展開著探索性研究。豆科植物根瘤的生化和分子生物學(xué)研究新陳代謝有大大促進(jìn)了我們的知識主要是植物碳，氮代謝，以及兩者之間的相互作用(萬斯埃塔爾，1994)。豆科植物與根瘤菌之間是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及雙方的合作伙伴從信號與識別，這種互利共生的植物和細(xì)菌，需要精湛的整合，以避免新陳代謝的一個(gè)伙伴剝削其他(Lodwig等，2003)。

基因倍增(Gene duplication)是指DNA片段在基因組中復(fù)制出一個(gè)或更多個(gè)拷貝，這種DNA片段可以是一小段基因組序列，也可以是整條染色體，甚至是整個(gè)基因組?；虮对鲋笪锓N基因組的一個(gè)共同特征就是都會有大量重復(fù)基因產(chǎn)生。植物基因組中大量的重復(fù)基因產(chǎn)生于基因組的多倍化(Polyploidy)，多倍化作為激變事件使基因組加倍，產(chǎn)生大量重復(fù)基因，重復(fù)基因的產(chǎn)生常會引起物種基因組大規(guī)模的變化，例如染色體重排、基因顛倒、基因丟失等等?；虮对鍪腔蚪M進(jìn)化的一種重要機(jī)制，是基因功能多樣化的前提，是物種演化最重要的動力源泉。基因倍增現(xiàn)象廣泛存在，在基因倍增的研究中，通過尋找同源片段并且結(jié)合片段中丟失的基因，來判斷大規(guī)模基因倍增的范圍。近年來基因倍增研究發(fā)現(xiàn)脊椎動物、模式植物、酵母等中存在不同程度的大規(guī)?；虮对?，有的甚至是全基因倍增。許多學(xué)者對于脊椎動物、禾本科植物以及其它真核生物等的基因倍增進(jìn)行了研究，揭示了其基因組中存在由基因倍增產(chǎn)生的大量重復(fù)基因基因倍增在酵母基因組的存在狀況成為近來研究的熱點(diǎn)之一，科學(xué)家反復(fù)深入和詳盡的研究在不斷揭示其基因倍增現(xiàn)象。

而共生固氮相關(guān)的基因家族與基因倍增的相關(guān)性研究目前尚是空白。因此我們將生物固氮和基因培增的基因組信息融合在一起，基于比較基因組學(xué)的方法初步探索Lotus japonicus基因倍增發(fā)生的規(guī)模，并統(tǒng)計(jì)分析影響共生固氮相關(guān)的基因與重復(fù)基因間的相關(guān)性。本文通過基因序列數(shù)據(jù)的比較分析，推斷影響基因倍增發(fā)生的幾個(gè)重要因素，并初步獲得影響共生固氮的遺傳學(xué)因素，加深對基因倍增和共生固氮的理解。

1 研究方法

1.1 Lotus japonicus基因組比較分析

首先是搜集模式植物L(fēng)otus japonicus基因組序列:Lotus japonicus基因組序列由www.kazusa.or.jp/lotus/下載得到，6條假染色體，15661個(gè)基因。下載得到的數(shù)據(jù)包含的信息有:①基因組CDS序列;②蛋白序列;③染色體序列;④基因在染色體上的位置。

序列比對(alignment)是指為確定兩個(gè)或多個(gè)序列之間的相似性以至于同源性，而將它們按照一定的規(guī)律排列。其目的是從核酸以及氨基酸的層次去分析序列的相同點(diǎn)和不同點(diǎn)，以推測他們的結(jié)構(gòu)、功能以及進(jìn)化上的聯(lián)系。

通過判斷兩個(gè)序列之間的相似性來判定兩者是否具有同源性.而分析基因相似性的工具是運(yùn)用基于動態(tài)規(guī)劃算法BLAST軟件。BLAST(Basic Local Alignment Search Tool基本局部比對搜索工具)是一套在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫或DNA數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性比較的分析工具。BLAST采用一種局部的算法獲得兩個(gè)序列中具有相似性的序列。

本文運(yùn)用的是BLAST的子程序blastp。blasp是蛋白序列到蛋白庫中的一種查詢。庫中存在的每條已知序列將逐一地同每條所查序列作一對一的序列比對。其使用取代矩陣尋找較遠(yuǎn)的關(guān)系，進(jìn)行SEG過濾。BLAST結(jié)果中的得分是對一種對相似性的統(tǒng)計(jì)說明。其中兩個(gè)重要的參數(shù)設(shè)置:Matrix(打分矩陣)選BLOSUM62;E值(E－value)表示僅僅因?yàn)殡S機(jī)性造成獲得這一比對結(jié)果的可能性。這一數(shù)值越接近零，發(fā)生這一事件的可能性越小。可以把每一個(gè)基因與其他任何一個(gè)基因相似性度量出來，最后篩選出具有相似性的基因。

1.2 分析確定基因同源性，統(tǒng)計(jì)重復(fù)基因規(guī)模

現(xiàn)代分子生物學(xué)中的同源性描述的是基因與基因之間相似關(guān)系，它表明的是兩個(gè)相比較的序列之間的匹配程度。一般來說，如果兩條基因序列相似性達(dá)80%，就可以把它們稱為"同源基因(homologousgene)"。而基因重復(fù)是指在同一個(gè)基因組內(nèi)存在2個(gè)或者2個(gè)以上拷貝的同源基因序列，是非常普遍的生物學(xué)現(xiàn)象。在已完成或即將完成全基因組測序的三大界生物(細(xì)菌、古菌和真核生物)基因組中，也已發(fā)現(xiàn)存在大量的重復(fù)基因。在植物界，基因重復(fù)現(xiàn)象更為普遍，僅在被子植物中就有大約70% ～80%的物種存在基因重復(fù)或多倍化過程，且發(fā)生在不同的進(jìn)化階段，許多物種是多次全基因組重復(fù)的產(chǎn)物?；蛑貜?fù)在生物進(jìn)化過程中發(fā)揮著極其重要的作用，是基因組和遺傳系統(tǒng)分化的重要推動力量。

基因倍增是指DNA片段在基因組中復(fù)制出一個(gè)或更多的拷貝，這種DNA片段可以是一小段基因組序列、整條染色體，甚至是整個(gè)基因組。基因倍增是基因組進(jìn)化最主要的驅(qū)動力之一，是產(chǎn)生具有新功能的基因和進(jìn)化出新物種的主要原因之一?；虮对鍪腔蚪M進(jìn)化的一種重要機(jī)制，是基因功能多樣化的前提，也是物種進(jìn)化的主要推動力。

我們通過比較分析確定同源基因以及基因在染色體的位置，繪制出二維平面圖。運(yùn)用MCscan來輸出共線性基因片段，其中重要的參數(shù)設(shè)置為min(－log10E_value，50)。獲得重復(fù)基因的個(gè)數(shù)以及確定由全基因倍增產(chǎn)生的重復(fù)基因規(guī)模。

1.3 共生固氮基因的比較分析構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹

系統(tǒng)學(xué)分類描述了不同生物之間的相關(guān)關(guān)系，通過系統(tǒng)學(xué)分類分析可以幫助人們了解所有生物的進(jìn)化歷史過程。這一過程并不能夠直接看到，人們只能通過相關(guān)線索了解歷史上曾經(jīng)發(fā)生了什么，而科學(xué)家就是用這些線索建立各種假說、模型，甚至是生命發(fā)生的歷史。系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究的是進(jìn)化關(guān)系，系統(tǒng)發(fā)育分析就是要推斷或者評估這些進(jìn)化關(guān)系。通過系統(tǒng)發(fā)育分析所推斷出來的進(jìn)化關(guān)系一般用分枝圖表(進(jìn)化樹)來描述，這個(gè)進(jìn)化樹就描述了同一譜系的進(jìn)化關(guān)系，包括了分子進(jìn)化(基因樹)、物種進(jìn)化以及分子進(jìn)化和物種進(jìn)化的綜合。在系統(tǒng)學(xué)分類的研究中，最常用的可視化表示進(jìn)化關(guān)系的方法就是繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，用一種類似樹狀分支的圖形來概括各種(類)生物之間的親緣關(guān)系。通過比較生物大分子序列差異的數(shù)值構(gòu)建的系統(tǒng)樹稱為分子系統(tǒng)樹。然后利用距離建樹方法是根據(jù)雙重序列比對的差異程度(距離)來建立進(jìn)化樹。

利用以上的基因比較所得到的共生固氮相關(guān)的同源基因在四個(gè)禾本科物種中進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析。首先運(yùn)用臨近距離方法，對共生固氮基因的蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，實(shí)現(xiàn)是應(yīng)用集成軟件Phylip輸出結(jié)果基因親緣關(guān)系的括號樹，并且對于獲得的進(jìn)化樹進(jìn)行了置換檢驗(yàn)(Bootsrap test)。

其次為了實(shí)現(xiàn)括號樹的可視化，使用的是MEGA軟件得到了基因間的進(jìn)化關(guān)系，來確定全基因倍增是否有利于該基因家族的擴(kuò)增;為了更好地揭示基因間的進(jìn)化情況，應(yīng)用MEGA還構(gòu)建了不同形式的進(jìn)化樹，若觀察發(fā)現(xiàn)某些基因樹枝長度明顯較長，則表明，在生物進(jìn)化過程中某些基因進(jìn)化速率較快。

2 相關(guān)結(jié)論及分析

2.1 基因組序列下載信息

Lotus japonicus基因組序列由www.kazusa.or.jp/lotus/下載得到，6條假染色體，15661個(gè)基因。下載得到的數(shù)據(jù)包含的信息有:①基因組CDS序列;②蛋白序列;③染色體序列;④基因在染色體上的位置。

2.2 相似性基因的比對與篩選

對Lotus japonicus基因組比較分析:用Bioperl程序包中的用Perl程序進(jìn)行翻譯，得到相應(yīng)的蛋白序列，應(yīng)用基于動態(tài)規(guī)劃算法BLAST軟件的子程序blastp(參數(shù)設(shè)置:E值＜1*10－5)做比較分析，把每一個(gè)基因與其他任何一個(gè)基因相似性度量出來，最后篩選出具有相似性的基因，部分結(jié)果如表1所示:

表1 Lotus japonicus基因組比對部分結(jié)果

2.3 確定重復(fù)基因規(guī)模

通過比較分析確定同源基因以及基因在染色體的位置，繪制出二維平面圖，如圖1所示。運(yùn)用MCscan輸出共線性基因片段，其中參數(shù)設(shè)置為min(－log10E_value，50)，共得到2197對重復(fù)基因。研究表明在Lotus基因組中存在大量的重復(fù)基因，由全基因倍增產(chǎn)生的重復(fù)基因規(guī)模為2197*2/15661=28.05%。

圖1 Lotus基因組中的重復(fù)基因

2.4 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，揭示基因間的進(jìn)化情況

由NCBI下載得到12條共生固氮相關(guān)基因，與二葉短柄草、水稻、高粱、玉米這四種植物的全基因組進(jìn)行比較分析，在4個(gè)物種中獲得的同源基因個(gè)數(shù)分別是31，19，28，18。初步對這五種植物的共生固氮基因家族進(jìn)行了定義。運(yùn)用臨近距離方法，對共生固氮基因的蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，實(shí)現(xiàn)是應(yīng)用集成軟件Phylip輸出結(jié)果基因親緣關(guān)系的括號樹(表2)，并且對于獲得的進(jìn)化樹進(jìn)行了置換檢驗(yàn)(Bootsrap test);對于括號樹的可視化，使用的是MEGA，基因間的進(jìn)化關(guān)系如圖(圖2);值得注意的是，樹中有很多重復(fù)的基因?qū)Υ嬖?，這一結(jié)果表明全基因倍增可能有利于該基因家族的擴(kuò)增;另外為了更好地揭示基因間的進(jìn)化情況，課題應(yīng)用MEGA還構(gòu)建了不同形式的進(jìn)化樹(圖3)，觀察可以發(fā)現(xiàn)有些基因樹枝長度明顯較長，這一現(xiàn)象表明，在生物進(jìn)化過程中有些基因進(jìn)化速率較快。

表2 水稻、高粱、二葉短柄草、玉米、Lotus共生固氮相關(guān)基因家族括號樹

3 結(jié)論

本文以Lotus japonicas作為模式植物，首先鑒定出以Lotus japonicas為研究對象的基因倍增發(fā)生的規(guī)模占有28.5%;其次搜集了Lotus japonicas、水稻、高粱、二葉短柄草、玉米這五種植物的部分共生固氮基因家族，運(yùn)用臨近距離方法來構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹的，通過對可視樹圖的分析，得出一個(gè)結(jié)論:全基因倍增可能有利于共生固氮基因相關(guān)的基因家族的擴(kuò)增;同時(shí)還發(fā)現(xiàn)在生物進(jìn)化的過程中有些基因進(jìn)化速率較快。

針對Lotus japonicas基因組進(jìn)行探索性研究，以共生固氮基因相關(guān)的基因家族與基因倍增的相關(guān)性為主題，有著重要的科學(xué)意義。它有助于回答一系列重要的科學(xué)問題，認(rèn)識到基因倍增的相關(guān)性、基因倍增發(fā)生的規(guī)模、發(fā)生的規(guī)律等。這一研究在方法上把數(shù)學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)、進(jìn)化理論與基因組學(xué)緊密結(jié)合，是很有意義的交叉學(xué)科研究，富有挑戰(zhàn)性。研究的結(jié)果使現(xiàn)代遺傳學(xué)深化對基因倍增和共生固氮的認(rèn)識。另外，這一研究有很強(qiáng)的可擴(kuò)展性，以Lotus japonicas為研究對象建立的相關(guān)方法和軟件在未來可被用于其他物種的進(jìn)一步探索，從而以更大的研究范圍來研究基因倍增與共生固氮的科學(xué)意義。

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