慢性乙肝患者血清HBV cccDNA檢測的臨床意義

楊彩娥，黃麗琴，孫 彬，何菊芳，韓 冰

1解放軍第309醫(yī)院 檢驗科，北京 100091；2河北北方學(xué)院，河北張家口 075000

目前慢性乙肝的實驗室檢查常采用免疫學(xué)指標HBeAg、HBV DNA反映病毒復(fù)制情況，其特異性好但靈敏度相對較低；采用生化指標ALT、AST、TBIL反映肝細胞損傷程度，其靈敏度好但特異性相對較差。共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)是HBV基因組復(fù)制中間體mRNA和前基因組RNA的模板，可長期存在于細胞核中，是HBV持續(xù)感染的關(guān)鍵，也是乙肝慢性化的主要原因[1-2]。當肝細胞變性壞死時，肝細胞核內(nèi)的cccDNA可釋放入血。有研究表明血清cccDNA與肝內(nèi)cccDNA有非常好的相關(guān)性[3]，且血清cccDNA可反映肝細胞損傷的嚴重程度。本文通過對58例慢性乙型肝炎患者血清HBV cccDNA與現(xiàn)有血清學(xué)指標的相關(guān)性分析，探討其在慢性乙肝患者病毒復(fù)制和肝細胞損傷評價中的意義。

材料和方法

1 標本采集及保存 標本來自解放軍第309醫(yī)院2009年5月-2012年5月58例門診和住院慢性乙肝患者，其中男48例，女10例。年齡18~80歲，平均46.25歲。診斷符合2010年修訂的《慢性乙型肝炎防治指南》[4]，排除甲、丙、丁、戊型肝炎和其他原因所致的肝損害。依據(jù)肝組織切片的病理組織學(xué)結(jié)果將肝組織炎癥分為輕度(G1-2)、中度至重度(G3-4)。診斷標準見《病毒性肝炎防治方案》[5]。抽取患者空腹靜脈血5 ml，待完全凝固后3 000 r/min離心10 min，分離血清置-80℃冰箱保存。

2 主要儀器與試劑 1)儀器：德國艾本德股份公司(Eppendorf)的Mastercycler ep realplex實時熒光定量PCR儀，羅氏公司的C6000免疫分析儀，日立Hi7600全自動生化分析儀。2)試劑：北京索奧生物醫(yī)藥科技有限公司的乙型肝炎病毒cccDNA核酸擴增檢測試劑盒檢測HBV cccDNA；上海復(fù)興公司的乙肝病毒核酸定量檢測試劑盒(PCR－熒光探針法)檢測HBV DNA；上海羅氏診斷產(chǎn)品有限公司的乙型肝炎病毒HBeAg檢測試劑盒(電化學(xué)發(fā)光法)檢測HBeAg；北京萊幫生物技術(shù)有限公司測定試劑盒檢測AST、ALT、TBIL。

3 HBV cccDNA的試劑準備 從試劑盒中取出HBV-cPCR MIX、Taq酶系，室溫融化并振蕩混勻。按樣本數(shù)(血清標本+陰性對照+陽性對照+標準品)n取HBV cccDNA PCR反應(yīng)液n×24μl、Taq酶n×2μl，充分混勻，10 000 r/min離心10 s。按每管26μl加入0.2 ml離心反應(yīng)管中。

4 HBV DNA的試劑準備 從試劑盒中取出HBVPCR緩沖液、Taq酶系、熒光探針、MgCl2。室溫融化并振蕩混勻10 s。按樣本數(shù)(血清標本+陰性對照+陽性對照+標準品)N取HBV PCR反應(yīng)液n×18μl、Taq 酶 n×2μl、熒光探針 n×3μl、MgCl2n×3μl，充分混勻，10 000 r/min離心10 s。按每管26μl加入0.2 ml離心反應(yīng)管中。

5 模板的提取 取50μl待檢血清標本(凍存血清使用前在室溫融解，并充分混勻)分別加入50μl核酸提取液A，振蕩混勻10 s，13 000 r/min離心10 min。棄去上清95μl，分別加50μl核酸提取液B至沉淀中，振蕩混勻10 s，100℃恒溫10 min，13 000 r/min離心3 min，上清即為模板。

6 HBV cccDNA標準品的配制 HBV-c陽性定量標準品用陰性質(zhì)控品梯度稀釋10倍、100倍、1 000倍，記為1×106Copies/ml，1×105Copies/ml，1×104Copies/ml的標準品。

7 標本加樣 HBV cccDNA和HBV DNA各自的模板、陰性對照、陽性對照、標準品各4μl加入反應(yīng)管中，置全自動定量PCR儀上進行反應(yīng)。

8 PCR擴增 1) HBV cccDNA PCR擴增：取PCR反應(yīng)管按順序放入PCR擴增儀中，按下面的程序設(shè)定反應(yīng)條件：93℃ 2 min，然后94℃ 5 s→55℃ 45 s，共40個循環(huán)。2) HBV DNA PCR擴增：取PCR反應(yīng)管按順序放入PCR擴增儀中，按下面的程序設(shè)定反應(yīng)條件94℃ 5 s→60℃ 40 s，共40個循環(huán)。3)結(jié)果分析：以高于樣本噪聲線和陰性對照的熒光值作為檢測閾值。4)質(zhì)量控制：試劑質(zhì)量完好并操作正確，陽性對照應(yīng)檢測為相應(yīng)的范圍，陰性對照應(yīng)表現(xiàn)為陰性結(jié)果。5)結(jié)果檢測：采用Mastercycler ep realplex專用軟件分析。

9 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)處理。HBV DNA與HBV cccDNA定量值取對數(shù)變換后，符合正態(tài)分布，二者相關(guān)性采用直線相關(guān)分析；計數(shù)資料采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 血清HBV cccDNA與ALT，AST和TBIL的相關(guān)性Tab.1 Correlation between serum HBV cccDNA and ALT, AST, TBIL(n, %)

結(jié) 果

1 血清HBV cccDNA與HBV DNA的相關(guān)性 慢性乙肝患者血清HBV cccDNA定量與血清HBV DNA定量呈正相關(guān)，見圖1。

圖1 血清HBV cccDNA與HBV DNA的相關(guān)性(r=0.880， P=0.000)Fig.1 Correlation between serum HBV cccDNA and HBV DNA(r=0.880， P=0.000)

2 血清HBV cccDNA與HBeAg的相關(guān)性 34例HBeAg陽性患者中有23例HBV cccDNA陽性，陽性比例達67.6%；24例HBeAg陰性患者中僅有9例HBV cccDNA陽性，陽性比例為37.5%。統(tǒng)計學(xué)分析顯示HBeAg陽性組HBV cccDNA陽性的比例高于HBeAg陰性組(χ2=5.170，P=0.023)。

3 血清HBV cccDNA與肝功能異常 肝功能異常以AST、ALT大于正常范圍的1.5倍、TBIL≥22μmol/l為標準。HBV cccDNA陽性、陰性者發(fā)生肝功能異常的比例無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。

4 血清HBV cccDNA與肝組織炎癥程度 23例輕度炎癥患者中有13例HBV cccDNA陽性，陽性比例為56.5%；35例中至重度炎癥患者中有29例HBV cccDNA陽性，陽性比例達82.9%，高于輕度炎癥組 (χ2=4.819，P=0.028)。

討 論

HBV cccDNA是乙肝病毒前基因組RNA復(fù)制的原始合成模板，對于乙肝病毒復(fù)制以及感染狀態(tài)的建立具有十分重要的意義。HBV cccDNA主要存在于宿主肝細胞核內(nèi)，傳統(tǒng)檢測方法是肝穿刺活組織檢查，患者不易接受，取材困難，臨床應(yīng)用受到極大限制。近年的研究表明乙肝患者血清中可檢測到HBV cccDNA，大多來源于受損的肝組織，一定程度可反映肝內(nèi)cccDNA的水平[3]。隨著PCR技術(shù)的逐步發(fā)展，血清HBV cccDNA的定量檢測在臨床上得到越來越廣泛的應(yīng)用。

本研究采用PCR方法結(jié)合Taqman熒光探針技術(shù)定量檢測血清HBV cccDNA，58例慢性乙肝患者血清中32例檢出cccDNA，其中HBeAg陽性組cccDNA陽性率達67.6%，高于HBeAg陰性組，與相關(guān)報道一致[6]。直線相關(guān)分析也顯示血清cccDNA載量與血清HBV DNA載量有很好的相關(guān)性，說明血清cccDNA是臨床判斷病毒復(fù)制的良好指標。此外，同一樣本中血清HBV DNA均高于cccDNA，可能因為血清HBV DNA是總DNA，包括cccDNA和基因組DNA，cccDNA只是HBV DNA的一部分。

從理論上推測，當肝組織處于炎癥活動階段時，存在于肝細胞核內(nèi)的HBV cccDNA，在肝細胞變性、壞死時也可以同轉(zhuǎn)氨酶一樣釋放到血液中，而且肝細胞損傷越嚴重，血液中的HBV cccDNA水平也越高[7-8]。本研究發(fā)現(xiàn)，82.9%的中至重度肝損傷患者血清HBV cccDNA呈陽性，高于輕度損傷者，說明血清HBV cccDNA與肝細胞損傷的嚴重程度相關(guān)，與相關(guān)報道一致[9-10]。本研究還調(diào)查了血清HBV cccDNA與肝功能異常的關(guān)系，統(tǒng)計學(xué)分析顯示HBV cccDNA陽性、陰性者發(fā)生肝功能異常的比例無統(tǒng)計學(xué)意義，可能因為HBV cccDNA升高先于ALT，在ALT升高之前，HBV cccDNA和HBV DNA就能夠達到檢出水平[7]。

1 姜友珍．乙型肝炎病毒cccDNA的研究進展［J］.中國自然醫(yī)學(xué)雜志，2010，12（3）：231-232．

2 唐麗，陳瑞琳．慢性乙型肝炎病毒感染者檢測血清乙型肝炎病毒共價閉合環(huán)狀DNA的臨床意義［J］.華西醫(yī)學(xué)，2010，25（2）：331-332．

3 覃亞勤，趙登蘊，劉彥慧，等．慢性HBV感染患者血清cccDNA與HBVDNA、HBeAg關(guān)系研究［J］.中國實驗診斷學(xué)，2009，13（9）：1193-1195．

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7 Chen Y， Sze J， He ML. HBV cccDNA in patients' sera as an indicator for HBV reactivation and an early signal of liver damage［J］. World J Gastroenterol， 2004， 10（1）： 82-85.

8 李紅，唐紅．乙肝病毒cccDNA檢測方法及臨床意義的研究進展［J］.生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2009，26（3）：662-666．

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