2008～2009年南寧市季節(jié)性H1N1亞型流感病毒血凝素HA1基因變異分析＊

范云燕，劉海燕，林新勤，秦劍秋，黃 莉 ，覃巍巍

（廣西壯族自治區(qū)南寧市疾病預(yù)防控制中心 530023）

流行性感冒是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，流感病毒分為 A、B、C 3種型別［1］。血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）是流感病毒主要表面抗原，尤其是HA基因具有高度易變性，是流感病毒發(fā)生抗原性漂移的主要原因［2］。流感病毒的HA基因在病毒受體識別和復(fù)制中起重要作用，它不僅與機(jī)體免疫密切相關(guān)，而且還是流感病毒發(fā)生抗原性變異的分子基礎(chǔ)。研究表明中和抗體針對的抗原位點(diǎn)和受體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）都位于 HA蛋白分子的頭部重鏈區(qū)（HA1）［3］。本研究通過分析2008～2009年度南寧市季節(jié)性H1N1流感病毒的流行和HA1基因的變異情況，有助于掌握流感病毒進(jìn)化方向和流行動態(tài)，為及時掌握本地區(qū)流感病毒活動動態(tài)，及早預(yù)測預(yù)警流感疫情提供實驗信息和依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2008～2009年南寧市流感病毒監(jiān)測哨點(diǎn)醫(yī)院采集到的流感樣病例咽拭子，流感疫情采集到的流感樣病例鼻咽拭子。

1.2 方法

1.2.1 病毒分離培養(yǎng) 將鼻咽拭子標(biāo)本接種于狗腎傳代細(xì)胞（MDCK）進(jìn)行流感病毒分離培養(yǎng)。根據(jù)采樣時間，2008年和2009年各選取10株季節(jié)性H1N1亞型流感毒株進(jìn)行序列測定分析。

1.2.2 病毒RNA的提取和HA基因全長擴(kuò)增 用QIAGEN Rneasy Mini kit RNA提取試劑盒提取20份毒株RNA，方法按試劑盒說明書。取5μL RNA模板，用引物 H1N1－HA－F：5′－AGC AGG GGA AAA TAA AAM CAA CC－3′進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，條件為：25℃10min，42℃1h，98℃5min，冰上冷卻。取5 μL cDNA為模板，分別用 H1N1－HA－F和 H1N1－HA－991R：5′－CAC TCT CCT ATT GTG ACT GGG TG－3′，以及 H1HAF768：5′－ACT ACT GGA CTC TGC TGG AAC－3′和 H1N1－HA－R：5′－TTC TGA AAT TCT GGT CTC AGA TGC－3′引物分別進(jìn)行PCR，PCR條件為：95℃3min，（94℃40s，52℃40s72℃1min）35個循環(huán)，72℃10min，50μL體系，以上反轉(zhuǎn)和PCR試劑均購自Fermentas。

1.2.3 HA基因測序和分析 PCR產(chǎn)物送北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行純化和測序，測序結(jié)果采用VectorNTI 9.0軟件進(jìn)行分析。將獲得的HA1氨基酸序列與WHO推薦的北半球 A亞型疫苗株 A／Solomon／3／2006（2007年11月至2008年4月，ABU50586）和 A／Brisbane／59／2007（2008年11月至2010年4月，ACA28844）進(jìn)行比對，并用 Mega4.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié) 果

2.1 2008、2009年南寧市 H1N1亞型流感病毒流行情況2008、2009年南寧檢測標(biāo)本分別為849份和863份，流感病毒分離培養(yǎng)陽性率為8.00%和26.65%，2008年以季節(jié)性H1N1（47.6%）和 H3N2（32.35%）為主，2009年以 H3N2（62.61%）為主，B型流感病毒（20.87%）其次。南寧市流感流行主要集中在夏秋季節(jié)，2008年和2009年分別在7月和9月達(dá)到病毒分離高峰。見圖1。

圖1 2008、2009年南寧市季節(jié)性流感毒株分離分布

2.2 核苷酸序列測定結(jié)果及氨基酸進(jìn)化樹分析 2008～2009年20株H1N1亞型流感病毒HA全長1 698bp翻譯成566個氨基酸，HA1長為325個殘基。將20株H1N1流感病毒HA1蛋白與北半球疫苗推薦進(jìn)行比對。20株H1N1聚成2個大的類群，其中A／Solomon／3／2006與2008年的毒株形成類群Ⅰ，而A／Brisbane／59／2007與2009年的毒株形成類群Ⅱ，兩疫苗株分別在類群中形成獨(dú)立的亞分支。

2.3 H1N1亞型流感病毒HA1氨基酸序列變異及蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)變化分析

2.3.1 HA1蛋白分子二硫鍵的變異和糖基化位點(diǎn)的變異情況 H1N1血凝素的基因翻譯后經(jīng)過剪切，52與284、65與77、100與145、289與313的半胱氨酸C間形成二硫鍵［4］。南寧市2008～2009年20株H1N1二硫鍵形成位點(diǎn)未發(fā)生氨基酸水平的插入、替換或缺失。HA蛋白潛在的糖基化位點(diǎn)序列為N－X－T／S［5］。對糖基化位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，兩疫苗株在 HA1區(qū)有8個糖基化位點(diǎn)，20份本地毒株除A／nanning／621／2008氨基酸發(fā)生突變（N54K），減少一個糖基化位點(diǎn)。其他毒株糖基化位點(diǎn)相對保守，未發(fā)現(xiàn)氨基酸替換。

表1 2008～2009人類季節(jié)性H1N1流感病毒HA1受體結(jié)合位點(diǎn)變異情況位點(diǎn)比對

2.3.2 HA1蛋白分子上受體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）的變異情況HA上的受體結(jié)合位點(diǎn)位于頭部末端（HA1部分），每個HA單體上有3個二級結(jié)構(gòu)分別是190螺旋，130環(huán)，220環(huán)［6］。HA1編碼序列受體結(jié)合位點(diǎn)變異情況見表1，在3個二級結(jié)構(gòu)中190的R188M（R188K）、A189T、H193N、T193K氨基酸位點(diǎn)均發(fā)生了整體的替換；220位環(huán)222位點(diǎn)在2008～2009年的毒株以及A／Brisbane／59／2007中均為氨基酸Q；另外，2009年的毒株中已有多個毒株130位環(huán)的131位點(diǎn)發(fā)生V131A（V131T）的替換。

2.3.3 HA1蛋白分子上抗原決定簇位點(diǎn)的變異情況 H1N1流感病毒HA1蛋白有4個抗原決定簇分別為Cb、Sa、Sb和Ca區(qū)［7－10］。通過對抗原位點(diǎn)的統(tǒng)計和分析，47個抗原位點(diǎn)有多個發(fā)生了變化，其中Sb、Ca、Cb位點(diǎn)相對活躍，而Sa位點(diǎn)相對保守。在發(fā)生氨基酸變異的抗原位點(diǎn)中，相對于A／Solomon／3／2006或A／Brisbane／59／2007毒株，20份毒株的 HA1發(fā)生替換的是Sb位點(diǎn)：185、188、189、192；Ca位點(diǎn)：141、167；Cb位點(diǎn)：73；Sa位點(diǎn)未發(fā)生氨基酸變異。2008年的10份毒株在188、189、193位點(diǎn)與兩疫苗株均不同；2009年毒株除個別毒株外，在185、189、141位點(diǎn)與 A／Brisbane／59／2007相比發(fā)生了整體 的 變 異，另 外 A／nanning／473／2009 和 A／nanning／662／2009分別在發(fā)生H192N、N167K點(diǎn)變異。

3 討 論

通過對本地檢測標(biāo)本統(tǒng)計分析，2008～2009年南寧流感流行主要集中在夏秋季節(jié)，H1N1和H3N2交替成為2008年和2009年的優(yōu)勢毒株。以上年度的H1N1血凝素基因重鏈區(qū)進(jìn)化樹顯示，A／Solomon／3／2006與2008年毒株屬于分支Ⅰ，而A／Brisbane／59／2007與2009年毒株屬于分支Ⅱ。A／Brisbane／59／2007作為2008年11月至2010年4月疫苗推薦毒株，與2008年毒株相距較遠(yuǎn)。本地毒株HA1氨基酸序列二硫鍵和糖基化位點(diǎn)比較保守；而HA1蛋白上的受體結(jié)合位點(diǎn)則相對活躍，其中190位環(huán)氨基酸位點(diǎn)變異最大，尤其是在188位和189位為高突變位點(diǎn)，但188位和189位氨基酸位點(diǎn)并不直接與宿主受體唾液酸發(fā)生結(jié)合，因此這些變化可能不影響RBS與受體結(jié)合的親和力［11］。Vines等［12］通過氨基酸定點(diǎn)替換實驗證明了流感病毒RBS第222位和224位氨基酸的變化決定了病毒感染宿主的特異性。當(dāng)H3病毒的HA同時發(fā)生L222Q、S224G突變時，可使感染人的H3流感病毒能夠感染禽類。本實驗當(dāng)中H1N1病毒的RBS的222和224位點(diǎn)分別為Q和G，這種替換是否影響病毒感染宿主的特異性，尚有待考證。流感病毒HA1蛋白上的抗原決定簇的變異情況是評價該毒株是否有流行病學(xué)意義的關(guān)鍵因素，新變種必須具備在其HA區(qū)抗原位點(diǎn)有4個以上氨基酸突變，而且必須分布在2抗原決定簇區(qū)［13］。分析表明，2009年毒株除 A／nanning／473／2009外，與對應(yīng)的疫苗株相比抗原決定簇區(qū)氨基酸變異未達(dá)到4個；2008年毒株與A／Solomon／3／2006相比則存在4個氨基酸的替換并且分布在兩個抗原決定簇區(qū)域。因此，可以推測，2008年根據(jù)WHO疫苗推薦株生產(chǎn)的疫苗對該年南寧市H1N1亞型流感預(yù)防效果可能并不理想，這將導(dǎo)致2008年南寧市 H1N1亞型的流行的強(qiáng)度明顯增加。而經(jīng)歷了2008年的流行后，人群中有了保護(hù)抗體，同時H1N1疫苗及時更新，使得H1N1在2009年流行強(qiáng)度有了明顯下降。

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