Pravastatin抑制心肌成纖維細胞膠原基因表達及其機制研究

鄭舒展，馮 健，余 琴，李家富

（瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院心內科，四川 瀘州 646000）

心肌纖維化（myocardial fibrosis，MF）系心肌細胞外基質中膠原纖維過量積聚、膠原含量顯著升高或膠原成分發(fā)生改變的病理過程，是心肌重構的一個重要特征，可導致充血性心力衰竭、惡性心律失常和猝死，因此研究MF的發(fā)生機制及尋求防治MF的有效措施具有重要的臨床意義。血管緊張素Ⅱ（angiotensionⅡ，AngⅡ）是目前研究表明最重要的致心肌肥厚因子，可直接通過1型受體介導刺激心肌成纖維細胞（cardiac fibroblasts，CF）增殖，膠原合成［1－2］。他汀類降脂藥物為3－羥基－3－甲基戊二酰輔酶A（HMG－CoA）還原酶抑制劑，近年研究表明該類藥物可延緩心肌重構，但其具體機制有待進一步闡明。本研究擬觀察pravastatin對AngⅡ誘導的CF增殖及膠原合成的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和試劑 1～3日齡的 Wistar大鼠（清潔動物）20只，雌雄不限，由瀘州醫(yī)學院實驗動物中心提供?？俁NA提取試劑Trizol購自Invitrogen公司；RT－PCR試劑盒購自TaKaRa公司；AngⅡ、Pravastatin、MTT、甲羥戊酸（Mevalonic acid，MVA）、焦磷酸法呢酯（farnesy－PP，FPP）、焦磷酸牛龍牛兒基牛龍牛兒酯（geranylgeranyl－PP，GGPP）均為Sigma公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 無菌條件下取 Wistar大鼠心室，剪碎，0.125%胰蛋白酶消化分離細胞，所得全部細胞置于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在5%CO2、37℃、孵箱中培養(yǎng)60～90min，差速貼壁法除去心肌細胞，剩下的細胞即為CF。細胞生長至匯合狀態(tài)采用0.25%胰蛋白酶消化傳代，2～4代細胞用于實驗，經倒置顯微鏡、免疫組化纖維黏連蛋白染色陽性鑒定為CF。將培養(yǎng)的CF分為：（1）空白對照組（A組）：不加干預藥物。（2）AngⅡ組（B組）：AngⅡ10－6mol／L。（3）Prav＋AngⅡ 組：Prav 10－6mol／L ＋ AngⅡ10－6mol／L （C組），Prav 10－5mol／L ＋AngⅡ10－6mol／L（D 組），Prav 10－4mol／L＋ AngⅡ10－6mol／L（E組）。（4）Prav10－4mol／L＋AngⅡ10－6mol／L＋MVA10－4mol／L 組（F組）。（5）Prav 10－4mol／L ＋AngⅡ10－6mol／L＋GGPP10－5mol／L 組 （G 組）。（6）Prav 10－4mol／L＋AngⅡ10－6mol／L＋FPP 10－5mol／L組（H 組）。每組重復4孔。

1.2.2 MTT比色法檢測細胞增殖 取對數生長期CF接種于96孔板，37℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)24h后，換1%血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24h使細胞進入生長靜止期，藥物干預48h，各組于藥物刺激結束前4h加入MTT 20μL，4h后終止培養(yǎng)，吸棄孔內培養(yǎng)上清液，加入150μL二甲基亞砜，振蕩10 min使使結晶充分溶解，在酶聯免疫檢測儀上490nm處測定吸光度值（A）。

1.2.3 細胞總RNA提取及RT－PCR 總RNA提取及RTPCR按說明書進行，取1μL總RNA按逆轉錄試劑盒說明書方法先逆轉錄合成第1條cDNA，Random 9mers作引物，逆轉錄酶為AMV，逆轉錄反應體系總體積為10μL，反應條件為：30℃10min，50℃20min，99℃5min，5℃5min，1個循環(huán)。以cDNA為模板用引物經PCR方法進行擴增。引物采用primer primer 5軟件設計并由大連寶生物公司合成，引物序列為PICP：上游 5′－TGC CGT GAC CTC AAG ATG TG－3′，下游5′－CAC AAG CGT GCT GTA GGT GA－3′。PCⅢ：上游5′－CCA CCC TGA ACT CAA GAG C－3′，下游 5′－TGA ACT GAA AGC CAC CAT T－3′ 。GAPDH：上 游 5′－ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC－3′，下 游 5′－TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA－3′。PⅠCP，GAPDH 的擴增條件為：94 ℃ 3 min，94℃30s，60℃30s，72℃2min，共30個循環(huán)。PⅠCP擴增片段大小為462bp，GAPDH片段大小452bp。PCⅢ的擴增條件為：94℃3min，94℃30s，54℃30s，72℃2min，共30個循環(huán)，產物片段大小為212bp。每組RT－PCR重復3次。PCR產物上樣于2%的瓊脂糖凝膠（含0.5μg／mL溴化乙錠），0.5×TBE作為電泳緩沖液，以5V／cm電壓電泳時間45 min。應用凝膠成像系統(tǒng)分析，以目的基因片段／GAPDH片段的條帶光密度值比值來表示其相對量。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析；計量資料組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 Prav對AngⅡ刺激下CF增殖的影響 圖1顯示，AngⅡ明顯促進 CF的增殖，與 A 組比較（P＜0.01）。Prav（10－6mol／L、10－5mol／L、10－4mol／L）呈濃度依賴性的抑制 AngⅡ刺激下的CF增殖。加入MVA、GGPP后F、G組可完全阻斷Prav的抑制作用，與E組比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。H組對Prav的作用無影響，與E組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2 Prav對AngⅡ刺激下成纖維細胞PⅠCP、PCⅢmRNA表達的影響 AngⅡ明顯刺激Ⅰ、Ⅲ型前膠原基因的表達，與A組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。Prav各濃度組C、D、E組與B組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），抑制作用具有濃度依賴性。加入 MVA，GGPP后F、G組可完全阻斷Prav的抑制作用，與E組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。H組對Prav的作用無影響，與E組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖2、3。

圖1 Prav對AngⅡ刺激下CF增殖影響各組的比較

圖2 RT－PCR電泳圖

圖3 Prav對AngⅡ作用下PICP、PCⅢmRNA表達的影響

3 討 論

心肌成纖維細胞過度增殖導致心肌纖維化發(fā)生發(fā)展，腎素－血管緊張素－醛固酮系統(tǒng)（RAAS）的激活是心肌纖維化的重要調控因素，其中AngⅡ是重要的促細胞生長因子。本研究顯示AngⅡ直接作用于CF，明顯刺激新生大鼠的心臟CF增殖和膠原基因的表達。膠原是心肌細胞外間質的主要成分，其中Ⅰ型膠原最多，Ⅲ型次之，膠原網在維護心臟結構和功能完整性上起重要作用，心肌膠原的組成及含量與心臟的收縮和舒張功能密切相關［3］。

已有研究表明，他汀類藥物具有減輕心肌重構的作用［4－5］，最近一項對隨機臨床試驗的Meta分析顯示：除了抑制心肌重構的作用之外，他汀類藥物還可以增加慢性心力衰竭患者的左室射血分數，改善心臟功能［6］。他汀類藥物的非降脂作用主要在于其抗炎癥、抗氧化，抑制細胞增殖［7］，抑制生長因子的表達［8］等作用。辛伐他汀可抑制脂多糖誘導的CF血管緊張素1型受體的蛋白表達，從而拮抗AngⅡ的作用［9］。普伐他汀發(fā)揮抗炎效應能減少心梗大鼠梗死區(qū)域的膠原含量從而改善心肌重構［10］。本研究觀察Prav直接作用于體外培養(yǎng)的CF，顯示Prav呈濃度依賴性的逆轉AngⅡ的刺激增殖作用，抑制CF的PICP、PCⅢmRNA表達，表明Prav從轉錄水平調節(jié)膠原的合成，拮抗AngⅡ誘導的心肌纖維化。

他汀類藥物的主要作用機制是通過競爭性抑制HMGCoA還原酶，在肝臟抑制膽固醇的合成，同時也阻斷甲羥戊酸和這一通路上其他重要的類異戊二烯中間體的生成，如MVA、FPP、GGPP等［11］。GGPP和FPP是小 GTP蛋白轉錄后修飾的重要脂質附屬物，提供異戊二烯基團使小GTP蛋白活化從而促進細胞增殖和分化。小GTP蛋白屬于Ras超家族，包括Ras、Rho和Rac等，由于Rho家族是龍牛兒基化作用的主要目標，所以抑制Rho的信號轉導活性及其與下游效應分子Rho激酶的結合可能是介導他汀類藥物對血管壁細胞及心臟細胞的某些非調脂效應的機制［12－13］。他汀類藥物抑制HMG－CoA還原酶后，抑制了由MVA代謝產生的GGPP、FPP的合成，從而阻止小GTP蛋白的活化。FPP主要提供法尼酯基團，與Ras的活化有關；Rho蛋白活化依賴于GGPP提供的二牛龍牛兒基團，AngⅡ可誘導新生SD大鼠CFBs的Rho激酶mRNA轉錄并活化Rho激酶，抑制Rho激酶活化對AngⅡ刺激的CFBs增殖與膠原合成具有明顯的抑制作用［14］。Porter KE等研究顯示通過抑制Rho的龍牛兒基化或者抑制Rho激酶的活性，可以達到同使用辛伐他汀后人心房肌成纖維細胞的增殖受抑制一樣的效果［15］。本實驗表明GGPP逆轉Prav的作用而FPP則不能，說明Prav主要通過抑制甲羥戊酸途徑，其中可能抑制Rho蛋白減少成纖維細胞增殖和膠原基因的表達，從而減緩心肌纖維化過程。

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