乙型肝炎病毒基因組1896位點(diǎn)變異株與野生株的定性檢測(cè)＊

郭龍華，陳 茶，萬(wàn)澤民，何文軍，吳新忠，周 強(qiáng)，馮春顏，吳文權(quán)

（1.深圳市龍華人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 深圳 518109；2.廣東省中醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣州 510120）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是不完全雙鏈環(huán)狀DNA病毒，HBV復(fù)制過(guò)程中要經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄，由于逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏有效的堿基校對(duì)功能，故HBV基因組比一般DNA病毒易發(fā)生變異［1－3］。HBV前C區(qū)定位于乙肝病毒基因組nt1814－1900，前C區(qū)是HBV基因組的高變區(qū)，前C區(qū)最常見(jiàn)的變異為G1896A點(diǎn)突變，使第28位密碼子TGG→TAG（終止子），翻譯提前終止，導(dǎo)致 HBeAg陰轉(zhuǎn)，影響干擾素療效［4－5］。目前一些常用方法對(duì)前C區(qū)1896位點(diǎn)變異株與野生株的混合感染易漏檢，本文介紹的方法能同時(shí)定性檢測(cè)前C區(qū)1896位點(diǎn)變異株與野生株，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清標(biāo)本 來(lái)源于廣東省中醫(yī)院2011年1月至2月門(mén)診和住院患者，共收集40例HBV DNA含量高于1×104IU／mL血清標(biāo)本。

1.1.2 主要儀器 Roche公司LightCycler型熒光定量PCR儀、法國(guó)VL公司Bio－1D型凝膠成像儀、飛鴿牌TGL－16B臺(tái)式高速離心機(jī)。

1.1.3 主要試劑 廣州達(dá)安基因公司HBV DNA熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒、蛋白酶K（Merck公司）、平衡酚（國(guó)產(chǎn)），裂解液（自配）。Taq DNA 酶（MBI公司）、dNTP（Promega公司）、DNA Marker（TaKaRa公司）。

1.1.4 引物設(shè)計(jì)與合成 參照GenBank中的HBV基因組序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)3條特異性引物：正義引物P1：5′－GAC TCT CAG CAA TGT CAA CG－3′（nt 1669－1688）；反義引物P2：5′－CGG GTC AAT GTC CAT GCC CC－3′（nt 1915－1896）；反義引物 P3：5′－CGG GTC AAT GTC CAT GCC CT－3′（nt 1915－1896）（針對(duì)突變株），由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。設(shè)計(jì)PCR終產(chǎn)物247bp。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本選取 用廣州達(dá)安基因公司HBV DNA熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)的HBV DNA含量高于1×104IU／mL血清標(biāo)本。HBV DNA的提取方法參照文獻(xiàn)［6］。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 每個(gè)標(biāo)本同時(shí)做2個(gè)擴(kuò)增管，一管加P1、P2（5μmol／L）各1μL，另一管加P1、P3（5μmol／L）各1μL，其余所加成分相同，10×緩沖液2μL，dNTP（10mmol／L）0.4 μL，Taq DNA 酶（1U／μL）0.5μL，MgCl2（25mmol／L）0.4 μL，模板2μL，ddH2O 12.7μL，總體積20μL，95℃5min。然后94℃0.5min，58 ℃ 0.5min，72 ℃ 0.5min共循環(huán)35次，72℃延伸5min。

1.2.3 PCR產(chǎn)物上電泳 取PCR產(chǎn)物在1.2%瓊脂凝膠（含EB）上電泳，觀察結(jié)果。

1.2.4 PCR產(chǎn)物測(cè)序 用試劑盒分別回收和純化各一管變異株、野生株P(guān)CR產(chǎn)物，送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

2 結(jié) 果

2.1 標(biāo)本擴(kuò)增結(jié)果 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。設(shè)計(jì)產(chǎn)物長(zhǎng)247bp，電泳結(jié)果與預(yù)期一致。本次實(shí)驗(yàn)共檢測(cè)40個(gè)標(biāo)本，有11個(gè)標(biāo)本只檢測(cè)到野生株，8個(gè)標(biāo)本只檢測(cè)到變異株，其余21個(gè)標(biāo)本都是變異株與野生株混合感染。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2 PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果

2.2.1 野生株P(guān)CR產(chǎn)物序列 GAC TCG CAG CAA TGT CAA CGA CCG ACC TTG AGG CAT ACT TCA AAG ACT GTT TGT TTA AGG ACT GGG AGG AGT TGG GGG AGG AGA TTA GGT TAA AGG TCT TTG TAC TGG GAG GCT GTA GGC ATA AAT TGG TCT GTT CAC CAG CAC CAT GCA ACT TTT TCA CCT CTG CCT AAT CAT CTC ATG TTC ATG TCC TAC TGT TCA AGC CTC CAA GCT GTG CCT TGG GTG GCT TTG GGG CAT GGA CAT TGA CCC G，序列中粗體字G為野生株1896位點(diǎn)。

2.2.2 變異株P(guān)CR產(chǎn)物序列 GAC TCG CAG CAA TGT CAA CGA CCG ACC TTG AGG CAT ACT TCA AAG ACT GTT TGT TTA AGG ACT GGG AGG AGT TGG GGG AGG AGA TTA GGT TAA AGG TCT TTG TAC TGG GAG GCT GTA GGC ATA AAT TGG TCT GTT CAC CAG CAC CAT GCA ACT TTT TCA CCT CTG CCT AAT CAT CTC ATG TTC ATG TCC TAC TGT TCA AGC CTC CAA GCT GTG CCT TGG GTG GCT TTA GGG CAT GGA CAT TGA CCC G，序列中粗體字A為變異株1896位點(diǎn)。

3 討 論

前C區(qū)是HBV基因組的高變區(qū)，前C區(qū)最常見(jiàn)的變異為G1896A，使第28位密碼子TGG→TAG（終止子），翻譯提前終止，導(dǎo)致HBeAg陰轉(zhuǎn)。一方面血液中的HBeAg可以干擾或抑制CTL對(duì)肝細(xì)胞膜上的HBcAg的攻擊，故HBeAg的減少可使CTL對(duì)肝細(xì)胞膜上的HBcAg攻擊得更為強(qiáng)烈，從而引起嚴(yán)重的肝損害，導(dǎo)致重癥肝炎。另一方面HBeAg陰轉(zhuǎn)時(shí)，影響干擾素對(duì)HBV的療效。

由于干擾素對(duì)乙型肝炎病毒患者抗病毒治療療程長(zhǎng)、存在不良反應(yīng)、患者花費(fèi)大，因而治療前需對(duì)患者進(jìn)行評(píng)估。HBeAg陰性患者，可用中藥方劑抗病毒治療［7］。干擾素治療對(duì)象主要是HBeAg陽(yáng)性患者。在HBV感染者體內(nèi)，常形成以一個(gè)優(yōu)勢(shì)株為主的相關(guān)突變株病毒群，稱為準(zhǔn)種（quasispecies）［8－9］，即變異株與野生株的混合感染。在 HBeAg陽(yáng)性患者體內(nèi)有些是G1896A點(diǎn)突變株和G1896野生株的混合感染，干擾素對(duì)G1896野生株有較好的療效，而對(duì)G1896A點(diǎn)突變株療效不好，對(duì)這類(lèi)患者用干擾素治療體內(nèi)會(huì)出現(xiàn)G1896A點(diǎn)突變株成為優(yōu)勢(shì)感染株，達(dá)不到抗病毒治療的效果，因而在干擾素治療前對(duì)患者是否為G1896A點(diǎn)突變株和G1896野生株的混合感染進(jìn)行檢測(cè)具有重要的臨床意義。如果單純是G1896野生株感染，可直接用干擾素治療。如果是G1896A點(diǎn)突變株和G1896野生株的混合感染，可用中藥方劑和干擾素進(jìn)行中西醫(yī)結(jié)合抗病毒治療。在治療用藥中和用藥后檢測(cè)，有利于療效和預(yù)后的判斷。目前一些常用方法［10－11］對(duì)前C區(qū)1896位點(diǎn)變異株與野生株的混合感染易漏檢，本法能同時(shí)檢測(cè)前C區(qū)1896位點(diǎn)變異株與野生株混合感染，PCR產(chǎn)物測(cè)序也證實(shí)了本法的特異性，且簡(jiǎn)單易行，成本較低，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

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