麻黃水提物霧化吸入對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥的影響＊

王 嬌，熊 瑛，熊 彬，王宋平△

（1.四川省崇州市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科 611230；2.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，四川 瀘州 646000）

支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱(chēng)哮喘）是由多種細(xì)胞和細(xì)胞組份參與的氣道慢性炎癥性疾病，糖皮質(zhì)激素是目前治療哮喘的主要方法，可以多途徑抑制哮喘氣道炎癥，但無(wú)法治愈，長(zhǎng)期使用可產(chǎn)生不良反應(yīng)，尋求更安全、有效的哮喘防治方法是當(dāng)前亟待解決的重要課題。麻黃作為治療咳喘病之要藥，具有發(fā)汗解表、宣肺平喘、利尿消腫之功效［1］，但有關(guān)麻黃水提物霧化吸入對(duì)哮喘氣道炎癥的影響尚缺乏深入研究。本課題以哮喘小鼠模型為研究對(duì)象，觀察麻黃水提物霧化吸入對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥和白細(xì)胞介素－13（IL－13）與嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子（Eotaxin）表達(dá)的影響，為臨床拓寬麻黃治療哮喘的新途徑提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 24只5～6周齡健康雌性BALB／c小鼠，體質(zhì)量16～20g（購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），在瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房飼養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑與儀器 卵清清蛋白（OVA）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，小鼠IL－13、Eotaxin ELISA試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司，兔抗小鼠IL－13、Eotaxin多克隆抗體購(gòu)自上海天呈科技有限公司。超聲霧化器：廣東汕頭光電醫(yī)療器械廠產(chǎn)品，電子天平：上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司，酶標(biāo)儀：美國(guó)Thermo產(chǎn)品，低溫高速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品，倒置相差顯微鏡：日本Olympus產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 麻黃水提物的制備 參照文獻(xiàn)［2］將麻黃50g（購(gòu)于瀘州圣杰藥房）加入500mL純凈水浸泡30min后，煎制1h，濃縮成濃度相當(dāng)于含生藥1g／mL的水煎劑，貯存于4℃冰箱備用。

1.2.2 動(dòng)物分組及建立哮喘模型 按照隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組、哮喘模型組、麻黃霧化吸入組（麻黃組），每組8只。哮喘模型的建立參考文獻(xiàn)方法［3－4］：除正常對(duì)照組外，哮喘模型組和麻黃組小鼠在第0、7天腹腔注射卵蛋白抗原液0.2mL（含100μg卵蛋白和1mg氫氧化鋁）致敏，致敏后第14天經(jīng)鼻吸入2%卵蛋白生理鹽水溶液激發(fā)，每次30min，1次／天，連續(xù)7d。正常對(duì)照組用等量生理鹽水代替卵蛋白抗原液進(jìn)行腹腔注射和經(jīng)鼻吸入致敏和激發(fā)。

1.2.3 給藥方法 麻黃組小鼠在每次經(jīng)鼻吸入卵蛋白抗原液激發(fā)前1h予以麻黃水提液霧化吸入30min，2次／天，連續(xù)7 d。正常對(duì)照組和哮喘模型組小鼠用等量生理鹽水代替麻黃水提液霧化吸入，吸入方法和時(shí)間同麻黃組。

1.2.4 支氣管肺泡灌洗液（BALF）細(xì)胞計(jì)數(shù) 各組小鼠末次給藥結(jié)束后24h內(nèi)用戊巴比妥腹腔注射麻醉小鼠后，常規(guī)消毒固定，暴露氣管行氣管插管，用PBS緩沖液0.8mL灌洗雙肺，反復(fù)抽吸3次，回收灌洗液，回收率大于或等于80%為合格標(biāo)本。BALF經(jīng)4℃1 500r／min離心10min后，取細(xì)胞沉淀用PBS液重懸，細(xì)胞懸液注入計(jì)數(shù)池，在顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，再換算成每升BALF的白細(xì)胞（WBC）總數(shù)；另取細(xì)胞懸液涂于載玻片上，經(jīng)姬姆莎染液染色后計(jì)數(shù)嗜酸性粒細(xì)胞（EOS）。

1.2.5 支氣管肺組織病理切片及HE染色 取左肺組織于4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)組織脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，厚度5μm、HE染色，光鏡下觀察支氣管及其周?chē)M織的病理改變。

1.2.6 免疫組化法檢測(cè)支氣管肺組織IL－13、Eotaxin的表達(dá) 支氣管肺組織切片采用鏈霉菌抗生物素蛋白－過(guò)氧化物酶連結(jié)（SP）法行免疫組織化學(xué)染色，操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，主要步驟如下：石蠟切片常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，3%H2O237℃孵育10min滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，置0.01mol／L枸櫞酸緩沖液（pH 6.0）中煮沸修復(fù)抗原，正常羊血清工作液封閉，37℃孵育10min，滴加1∶100兔抗鼠多克隆抗體（一抗）4℃孵育過(guò)夜（用PBS液代替一抗作陰性對(duì)照），PBS沖洗3次，每次5min，滴加生物素標(biāo)記羊抗兔血清（二抗），37℃孵育30min，PBS沖洗3次，每次5min，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉素卵白素工作液，37℃孵育30min，PBS沖洗3次，每次5min，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）染色，自來(lái)水沖洗蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、干燥、封片。染色結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)［5］：在光鏡下觀察出現(xiàn)棕黃色或黃褐色染色的細(xì)胞判定為陽(yáng)性細(xì)胞，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（×400）進(jìn)行平均光密度測(cè)定，取其平均值作為該片代表值，采用Image－pro plus 6.0圖像分析系統(tǒng)計(jì)算平均光密度值（AOD）。

1.2.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法測(cè)定IL－13、Eotaxin的濃度 取右側(cè)支氣管肺組織100mg加入1mL PBS液研磨勻漿后，3 000r／min離心20min后，取上清液，采用ELISA法測(cè)定上清液中IL－13、Eotaxin蛋白的濃度。操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，在450nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔樣品的吸光度（OD）值，根據(jù)OD值計(jì)算出各樣品中IL－13、Eotaxin蛋白的濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（方差不齊采用Games Howell法，方差齊同采用LSD法進(jìn)行兩兩比較），兩變量的相關(guān)分析采用Bivariate過(guò)程的等級(jí)Pearson相關(guān)法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠一般狀況 哮喘模型組和麻黃組小鼠激發(fā)后可見(jiàn)其煩躁不安，呼吸急促，抓鼻，打噴嚏，行動(dòng)遲緩或俯臥不動(dòng)，但麻黃組癥狀較輕，正常對(duì)照組無(wú)上述表現(xiàn)。

2.2 BALF中 WBC和EOS計(jì)數(shù) 哮喘模型組和麻黃組BALF中WBC、EOS計(jì)數(shù)明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；但麻黃組BALF中 WBC、EOS計(jì)數(shù)均低于哮喘模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表1。

表1 3組小鼠BALF中WBC及EOS計(jì)數(shù)比較

表1 3組小鼠BALF中WBC及EOS計(jì)數(shù)比較

▲：P＜0.01，與正常對(duì)照組比較；★：P＜0.01，與哮喘模型組比較。

組別WBC EOS正常對(duì)照組3.75±0.43 0.03±0.01哮喘模型組 17.74±0.79▲ 1.81±0.05▲麻黃組 8.57±0.51▲★ 0.52±0.03▲★

2.3 支氣管肺組織病理形態(tài)學(xué)改變 正常對(duì)照組見(jiàn)氣道上皮完整，支氣管、細(xì)支氣管壁平滑肌層較薄，管腔規(guī)則，無(wú)明顯分泌物貯留，黏膜皺襞矮平，肺泡間隔正常，周?chē)鸁o(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；哮喘模型組支氣管上皮有脫落不完整，氣道上皮細(xì)胞增生肥大，管腔有明顯狹窄，平滑肌增厚，支氣管周?chē)罅垦装Y細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔增厚，管腔內(nèi)可見(jiàn)黏液栓；麻黃組支氣管周?chē)胺闻輩^(qū)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及管腔黏液栓均較哮喘模型組減少，支氣管壁肺泡間隔增厚及管腔狹窄均較哮喘模型組減輕，見(jiàn)圖1。

2.4 支氣管肺組織IL－13、Eotaxin免疫組化染色結(jié)果 IL－13、Eotaxin陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物主要位于支氣管上皮細(xì)胞及間質(zhì)中炎癥細(xì)胞的細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色或黃褐色顆粒樣分布。正常對(duì)照組可見(jiàn)氣道黏膜、黏膜下層有少量呈棕黃色的陽(yáng)性細(xì)胞；哮喘模型組可見(jiàn)氣道黏膜、黏膜下層、血管周?chē)?、肺泡區(qū)有大量呈棕黃色的陽(yáng)性細(xì)胞，以氣道黏膜上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、炎癥細(xì)胞表達(dá)明顯。通過(guò)分析比較AOD，哮喘組表達(dá)均明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.01）；麻黃組表達(dá)相對(duì)于哮喘模型組均有減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖2、3，表2。

圖1 3組支氣管肺組織病理形態(tài)學(xué)改變（HE×200）

圖2 3組支氣管肺組織IL－13蛋白表達(dá)（SP×200）

圖3 3組支氣管肺組織Eotaxin蛋白表達(dá)（SP×200）

表2 3組支氣管肺組織IL－13、Eotaxin蛋白表達(dá)比較

表2 3組支氣管肺組織IL－13、Eotaxin蛋白表達(dá)比較

▲：P＜0.01，與正常對(duì)照組比較；★：P＜0.01，與哮喘模型組比較。

組別IL－13 Eotaxin正常對(duì)照組0.198±0.091 0.188±0.068哮喘模型組 0.448±0.141▲ 0.419±0.103▲麻黃組 0.226±0.08 8★ 0.218±0.057★

2.5 ELISA法測(cè)定IL－13、Eotaxin濃度結(jié)果比較 哮喘模型組和麻黃組支氣管肺組織勻漿上清液中IL－13、Eotaxin濃度明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.01），但麻黃組上清液中IL－13、Eotaxin的濃度低于哮喘模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表3。

表3 3組支氣管肺組織勻漿上清液中IL－13、Eotaxin濃度比較

表3 3組支氣管肺組織勻漿上清液中IL－13、Eotaxin濃度比較

▲：P＜0.01，與正常對(duì)照組比較；★：P＜0.01，與哮喘模型組比較。

組別IL－13 Eotaxin正常對(duì)照組1 145.993±134.669 717.355±60.491哮喘模型組 3 489.909±235.925▲ 1 262.709±114.516▲麻黃組 2 470.610±138.882▲★ 918.608±58.127▲★

2.6 相關(guān)性分析 直線相關(guān)分析顯示，哮喘模型組EOS計(jì)數(shù)與IL－13、Eotaxin表達(dá)呈正相關(guān)（r＝0.746、0.712，P＝0.033、0.048）；麻黃組 EOS計(jì)數(shù)與IL－13、Eotaxin表達(dá)也呈正相關(guān)（r＝0.729、0.734，P＝0.040、0.038）；IL－13與 Eotaxin在哮 喘組（r＝0.803，P＝0.028）或麻黃組（r＝0.761，P＝0.016）的表達(dá)均呈正相關(guān)。

3 討 論

哮喘是由多種細(xì)胞參與的氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性為特征的慢性炎癥性疾病［6］。EOS是參與氣道炎癥的主要細(xì)胞，EOS合成、釋放的各種炎癥介質(zhì)導(dǎo)致支氣管平滑肌收縮，微血管滲漏和黏液分泌增加［7－8］。Eotaxin可趨化EOS聚集到氣道上皮并活化、釋放各種炎癥介質(zhì)導(dǎo)致氣道上皮損傷［9－10］。IL－13是與哮喘發(fā)病直接相關(guān)的Th2細(xì)胞因子，與氣道黏液高分泌和氣道高反應(yīng)性密切相關(guān)［11－12］，IL－13與 Eotaxin相互作用，共同調(diào)節(jié)EOS在氣道的募集、活化，使氣道炎癥的持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)［13－14］。

麻黃具有發(fā)汗解表、宣肺平喘、利尿消腫之功效。麻黃堿是其平喘的主要成分，可直接興奮支氣管平滑肌細(xì)胞的β受體，舒張支氣管平滑肌。我們先前的研究結(jié)果表明，給予麻黃水提物灌胃預(yù)處理哮喘豚鼠，氣道上皮損傷、脫落及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕，提示麻黃灌胃具有抑制哮喘豚鼠氣道炎癥的作用［14］，但麻黃口服給藥雖對(duì)支氣管平滑肌有舒張作用，但同時(shí)對(duì)橫紋肌也有興奮作用，使心率加快，外周血管收縮，血壓升高，劑量過(guò)大可導(dǎo)致失眠，心煩不安和顫抖［15］。吸入療法是治療呼吸系統(tǒng)疾病的常用方法，與口服給藥相比，霧化吸入給藥具有局部藥物濃度高、起效迅速、所需劑量小、全身不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)［16］。

本研究中觀察到哮喘小鼠BALF中WBC、EOS計(jì)數(shù)較正常對(duì)照組明顯增高，氣道上皮細(xì)胞增生肥大，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，管腔內(nèi)可見(jiàn)黏液栓，支氣管肺組織中IL－13、Eotaxin的表達(dá)量明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.01），與文獻(xiàn)報(bào)道一致［17］。給予麻黃水提物霧化吸入干預(yù)后，結(jié)果顯示BALF中 WBC、EOS計(jì)數(shù)較哮喘模型組小鼠明顯減少（P＜0.01），氣道上皮炎癥程度減輕，支氣管及周?chē)装Y細(xì)胞浸潤(rùn)減少，支氣管肺組織中IL－13、Eotaxin蛋白表達(dá)減弱，其表達(dá)量明顯低于哮喘模型組小鼠（P＜0.01），相關(guān)性分析顯示，BALF中EOS計(jì)數(shù)與支氣管肺組織中IL－13、Eotaxin的表達(dá)量呈正相關(guān)。本研究結(jié)果表明，哮喘小鼠支氣管肺組織中存在IL－13、Eotaxin蛋白表達(dá)上調(diào)，麻黃水提取物經(jīng)霧化吸入途徑給藥可抑制哮喘小鼠的氣道炎癥和EOS浸潤(rùn)，抑制IL－13與Eotaxin蛋白的表達(dá)，這可能是其治療支氣管哮喘的作用機(jī)制之一。

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