索拉非尼誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡過程中Mcl－1與bFGF－2的表達(dá)及意義＊

廖 于，李照東，左的于，劉 宇，晏 勇，左國慶

（1.重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校 401331；2重慶醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院 400010；3重慶醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院 400016；4.重慶市中醫(yī)院 400021）

索拉非尼是世界上第一個新型多靶向性的抗腫瘤的口服藥物，絕大部分患者對其應(yīng)答效果好，癥狀緩解率高，不良反應(yīng)?。?］。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證索拉非尼在體外引起肝癌細(xì)胞凋亡，并測定Mcl－1及bFGF－2的表達(dá)，探討髓樣細(xì)胞白血?。?蛋白質(zhì)（Mcl－1）、人堿性成纖維細(xì)胞生長因子－2（bFGF－2）在肝癌細(xì)胞凋亡過程中表達(dá)變化的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 索拉菲尼購于德國拜耳制藥（每粒200mg），CCK－8試劑盒購于江蘇碧云天生物技術(shù)研究所，AnnexinV－EGFP凋亡試劑盒購于上海貝博生物公司，人bFGF－2ELISA試劑盒購于武漢博士德生物公司，鼠抗人 Mcl－1多克隆抗體購于美國Santa Cruz，人肝癌細(xì)胞株HepG2保存于重慶醫(yī)科大學(xué)肝病研究所。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于10%滅活小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中（含有1%的雙抗），置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞為貼壁生長，每1～2天換液，2～3d傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 索拉菲尼溶液的制備 用少量100%的二甲亞砜（DMSO）完全溶解索拉菲尼，用1640培養(yǎng)基稀釋到所需濃度備用，使DMSO的最終濃度低于0.5%。

1.2.3 CCK－8試劑盒檢測藥物對腫瘤細(xì)胞增殖的影響 將對數(shù)生長期細(xì)胞常規(guī)消化后按5×103／孔接種于96孔板，培養(yǎng)12h后加入藥物。實(shí)驗(yàn)分組及相關(guān)濃度參照文獻(xiàn)［2］定為索拉菲尼1.5、3.0、6.0μmol／L組，每組設(shè)3個復(fù)孔，另設(shè)對照組。每孔所加不同濃度藥物對應(yīng)的量均為20μL，加入培養(yǎng)基使每孔的最終體積為200μL。分別作用24、36、48、60、72h后每孔加入20μL CCK－8，37℃下作用1h，酶標(biāo)儀測定各孔在450nm處的吸光度值（A450）。細(xì)胞生存率（%）＝處理組A值／對照組A值×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞儀分析法測定細(xì)胞凋亡 以5×104／孔接種HepG2細(xì)胞于6孔板，待細(xì)胞貼壁后加入處理因素，60h后收集細(xì)胞，離心5min，去掉上清液，冷PBS輕柔沖洗1次，加入400μL緩沖液，加入10μL的Annexin V，避光于孵箱中孵化5min，再加入5μL的PI繼續(xù)孵化10min，上機(jī)檢測。

1.2.5 ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中的bFGF－2表達(dá)情況 改用高糖無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，于細(xì)胞對數(shù)期加入相應(yīng)處理因素，繼續(xù)培養(yǎng)60h后提取各組細(xì)胞培養(yǎng)液。按照試劑盒說明依次操作，終止反應(yīng)后，酶標(biāo)儀測定A450，繪制bFGF－2濃度水平標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 Western－blot法檢測細(xì)胞中 Mcl－1的表達(dá)情況 取對數(shù)生長期細(xì)胞加入處理因素，60h后消化細(xì)胞，4℃、1 000 r／min離心5min收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液冰上裂解25min，提取總蛋白質(zhì)，BCA比色法測定蛋白濃度，SDS－PAGE電泳（每孔上樣25μL）后經(jīng)轉(zhuǎn)膜封閉1h，4℃一抗孵育過夜，在搖床上洗膜3到4次，加二抗常溫孵育1h，再次洗膜3次后用ECL發(fā)光法顯示成像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以表示，采用單因素方差分析：兩兩比較，假定方差齊性LSD（L），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CCK－8檢測肝癌細(xì)胞抑制率結(jié)果 與對照組抑制率相比，索拉非尼各濃度組（1.5、3.0、6.0μmol／L）均能有效抑制肝癌細(xì)胞增殖，呈一定的時間－量效關(guān)系（F＝438.841，P＜0.05）。各用藥組約在60h到達(dá)平臺期。見圖1。

圖1 細(xì)胞生長抑制曲線

圖2 對照組的流式細(xì)胞分析

2.2 流式細(xì)胞儀檢測肝癌細(xì)胞凋亡結(jié)果 索拉非尼各濃度組（由低到高）誘導(dǎo)細(xì)胞早期凋亡率分別為（14.23±3.12）%，（35.28±3.98）%，（60.32±4.11）%，對照組早期凋亡率為（6.12±2.36）%。各組相比，高濃度的索拉非尼組更能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡（F＝1 404.051，P＜0.05），見圖2～5。

圖3 索拉菲尼1.5μmol／L組的流式細(xì)胞分析

圖4 索拉非尼3.0μmol／L組的流式細(xì)胞分析

圖5 索拉非尼6.0μmol／L組的流式細(xì)胞分析

圖6 各組Mcl－1蛋白質(zhì)表達(dá)情況（Western blot）

2.3 各組細(xì)胞培養(yǎng)液中bFGF－2表達(dá)情況 對照組（252.85±5.32）pg／mL，索拉非尼1.5μmol／L組（190.13±6.88）pg／mL，索拉非尼3.0μmol／L組（130.36±4.45）pg／mL，索拉非尼6.0μmol／L組（45.31±4.19）pg／mL。各用藥組與對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），高濃度組效果優(yōu)于低濃度組（F＝7 534.523，P＜0.05）。

2.4 各組Mcl－1蛋白質(zhì)表達(dá)情況 在免疫印跡帶上，與對照組相比，高濃度的索拉非尼組的 Mcl－1表達(dá)明顯減少，而低濃度的索拉非尼組的Mcl－1減少相對較少。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，索拉非尼能導(dǎo)致肝癌細(xì)胞凋亡，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其機(jī)制主要是在帶有致癌的K－ras和b－raf的突變體腫瘤細(xì)胞內(nèi)，索拉非尼能夠抑制絲裂酶原活化蛋白激酶（MAPK）的傳導(dǎo)通路，從而干擾細(xì)胞周期［3］。同時，它阻斷Raf／MEK／ERK通路介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)，還可以抑制多種受體酪氨酸激酶，包括新生血管有關(guān)的血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR－2、VEGFR－3）、血小板衍生生長因子受體、腫瘤生長相關(guān)的干細(xì)胞因子受體（C－kit）以及Fms樣酪氨酸激酶3（FIt－3）等［4］。而新近文獻(xiàn)報(bào)道 Mcl－1也是索拉非尼的靶點(diǎn)之一，其主要作用為誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡［5］。Mcl－1是B細(xì)胞淋巴瘤／白血病－2基因（bcl－2）家族的一員，它的主要作用為促進(jìn)細(xì)胞生存，抑制細(xì)胞凋亡［6］，且在肝癌組織的表達(dá)顯著高于癌旁組織，并與腫瘤大小，分級無關(guān)［7］。有學(xué)者認(rèn)為bcl－2家族的高表達(dá)也是引起肝癌對常規(guī)抗腫瘤藥物易產(chǎn)生耐藥的主要原因之一，所以，索拉非尼下調(diào) Mcl－1在對于多藥物聯(lián)合抑制肝癌方面有著更深遠(yuǎn)的意義［8］。

bFGF－2屬于擁有廣泛促細(xì)胞分裂作用的bFGF家族。它們參與一系列生理過程，包括胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、組織修復(fù)、腫瘤生長和浸潤［9－10］。在促進(jìn)腫瘤生長方面的機(jī)制主要是由于bFGF作為一種細(xì)胞有絲分裂原和促血管生成因子，可直接作用于腫瘤細(xì)胞，使其分泌各種蛋白分解酶和膠原酶，從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移和浸潤；另外，對活動期腫瘤，它明顯促進(jìn)腫瘤血管的形成，并且通過腫瘤毛細(xì)血管內(nèi)皮增殖，增加腫瘤血液供應(yīng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分裂［11－12］。bFGFS／bFGFRS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與腫瘤發(fā)生關(guān)系密切，多種腫瘤細(xì)胞過量表達(dá)bFGFR1和abFGF／bFGF，以bFGFR1和aFGF／bFGF過量表達(dá)為特征的自分泌信號環(huán)路是腫瘤惡性增生的首要條件［13－14］。臨床上，原發(fā)性肝癌患者服用索拉非尼后，血清bFGF－2表達(dá)明顯減少［15］，這與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。

綜上，索拉非尼能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，并伴有 Mcl－1和bFGF－2表達(dá)下調(diào)。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)，提示 Mcl－1與bFGF－2在腫瘤細(xì)胞的增殖、分化及凋亡過程中具有十分重要的作用，這對進(jìn)一步揭示肝癌發(fā)生機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新的肝癌診斷標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)均有重要意義。

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