血脂平穩(wěn)度對兔動脈粥樣硬化病變進展的影響

鄒 曉，司全金，蔡力力

解放軍總醫(yī)院，北京 100853 1南樓心血管一科；2南樓臨床檢驗科

血脂代謝紊亂與動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的形成密切相關(guān)，研究顯示，血脂持續(xù)異常是促進AS發(fā)生及發(fā)展的重要因素，但臨床中常常有部分患者既往存在血脂水平升高，但急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)發(fā)生時低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)反而處于較低水平，因此，粥樣斑塊的穩(wěn)定性是否與血脂水平波動有關(guān)不得而知。該研究通過制造血脂波動模型，觀察血脂水平顯著波動與斑塊穩(wěn)定性之間的關(guān)系，進一步探討血脂異常影響動脈粥樣斑塊的方式及機制。

材料與方法

1 試劑及儀器 高脂、低脂及普通飼料(北京市科傲公司)，血脂及ELISA試劑盒(羅氏公司)；Thermo IEC CL40離心機(公司)，全自動生化分析儀(Roche Hitachi917型(公司)，瑞典產(chǎn)LKB-Ⅲ型超薄切片機，OLYMPUS BX60型雙目顯微鏡。西門子公司SEQUOIA512型超聲儀，探頭頻率8~14 MHz。

2 實驗動物與分組 24只12周齡的健康雄性新西蘭大耳兔，體質(zhì)量2.0~2.5 kg，由本院實驗動物中心提供(許可證編號：SCXK(京)2007-0003)，環(huán)境適應飼養(yǎng)1周后隨機分為3組：空白組(A)6只，飼普通料；對照組(B)9只，持續(xù)以含1%膽固醇、3%豬油的高脂飼料飼養(yǎng)；血脂波動組(C)9只，高脂飼料飼養(yǎng)至12周動脈粥樣硬化模型成功建立后，與低脂飼料每隔3周交替喂養(yǎng)1次，即12周換低脂飼料、15周換高脂飼料、18周換低脂飼料、21周換高脂飼料[1]。3組動物飼料120 g/d，自由飲水，共喂養(yǎng)24周。實驗過程中因腹瀉及不明原因死亡4只，剩余20只納入有效樣本統(tǒng)計分析。

3 血清生化檢測及主動脈超聲檢測 A、B兩組于0、12、24周末、C組于0、12、15、18、21、24周末經(jīng)兔耳緣靜脈空腹采血，血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、LDL-C檢測采用羅氏公司試劑在本院生化室用免疫比濁法完成，ELISA法測血清超敏C反應蛋白(high-sensitivity C-reactive protein，hs-CRP)水平。根據(jù)血脂原始參數(shù)計算血脂平穩(wěn)度，以血脂平穩(wěn)指數(shù)(smoothness index，SI)表示，SI=-x/s(-x與s分別指12~24周5次采血各血脂水平的均值與標準差)，SI值越高說明血脂平穩(wěn)度越好，反之則說明血脂水平波動大。應用超聲儀于實驗開始、12周末及24周末行腹主動脈超聲檢測。

4 病理形態(tài)學觀察 24周末處死動物，取主動脈剝離外膜脂肪組織，縱行剖開置于多聚甲醛中固定保存。大體標本行油紅染色后攝像，利用生物醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)(Image-pro plus)測定斑塊面積和內(nèi)膜面積，計算斑塊與內(nèi)膜面積百分比。于主動脈弓處取材，常規(guī)石蠟包埋，制成厚約5 μm橫截面切片，行蘇木素-伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)。

5 數(shù)據(jù)處理 結(jié)果計算均采用-x±s表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS13.0軟件分析。計量資料采用t檢驗和方差分析。

結(jié) 果

1 實驗動物一般情況 實驗過程中A組不明原因死亡2只，B、C組因腹瀉各死亡1只，最終剩余20只動物資料納入統(tǒng)計學分析。喂養(yǎng)24周后，各組動物體重均較喂養(yǎng)前顯著增加(P＜0.01)，24周體重明顯大于12周(A組P＜0.05，余P＜0.01)，但各組之間比較無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，見表1。

2 血脂參數(shù)、SI及血清hs-CRP變化 C組通過交替高低脂飼料，成功制作高低血脂波動模型(圖1)。12周時，B組和C組動物血清TC、LDL-C、hs-CRP水平均較0周及A組明顯升高，HDL-C則較0周及A組顯著降低(P＜0.01)；24周時，C組血清TC、LDL-C水平明顯低于B組(P＜0.05)，血清hs-CRP水平明顯高于12周水平及B組(P＜0.01)。24周時，B、C組SI均低于A組，C組TC與LDL-C SI值低于B組的12.51，見表1。

表1 三組體重、SI、血脂及hs-CRP比較Tab. 1 Weight, SI and serum lipid and hs-CRP level in 3 groups

圖 1 C組不同周數(shù)血脂水平Fig. 1 Lipid level in group C at different weeks

3 主動脈超聲 造模前3組兔腹主動脈均內(nèi)壁光滑，內(nèi)膜不易顯示，管壁無隆起、增厚、斑塊形成。高脂喂養(yǎng)后，動脈管壁表現(xiàn)內(nèi)-中膜厚度(intima-media thickness，IMT)增厚，局部隆起甚至多發(fā)斑塊形成。0周時，各組動物主動脈IMT無統(tǒng)計學差異，飼養(yǎng)12周后，B、C組IMT明顯高于0周及空白對照組(P＜0.01)，且兩組血管內(nèi)可見明顯斑塊形成；24周時，C組IMT明顯高于其12周值(P＜0.05)，且高于B組(P＜0.01)，見表2。另外，同一血管部位斑塊不同周數(shù)比較，12周時B組斑塊(0.74×3.46) mm、C組(0.80×4.9) mm，24周時B組(0.75×4.34) mm、C組(1.40×9.90) mm，可見C組斑塊增長速度明顯大于B組。

表2 三組不同周數(shù)IMT比較Tab.2 IMT in 3 groups at different weeks(mm)

圖 2 主動脈粥樣硬化病變血管內(nèi)膜油紅染色Fig. 2 Oil red staining of atherosclerotic intima

圖 3 三組動脈粥樣斑塊HE切片比較Fig. 3 HE staining of atherosclerotic plaque sections from 3 groups A: normal intima in group A(×200); B：structure of atherosclerostic plaque in group B (×100); C：structure of atherosclerostic plaque in group C (×200); D：revas-cularization in group C(×400)

4 動脈粥樣硬化斑塊面積百分比 血管內(nèi)膜油紅染色顯示，動脈粥樣硬化病變處被染成紅色(圖2)。C組斑塊面積百分比為(53.53±22.6)%，明顯較B組(33.90±24.91)%高(P＜0.05)。肉眼下可見A組主動脈內(nèi)膜光滑，未被油紅著色，未見粥樣硬化斑塊；B組主動脈內(nèi)膜有較嚴重的粥樣硬化病變，可見脂樣物質(zhì)突出管腔，呈點、斑、條狀隆起，邊緣清楚，表面無明顯破潰，較嚴重者斑塊融合成片，以主動脈起始部為重；C組主動脈內(nèi)膜有嚴重粥樣斑塊病變，密布內(nèi)膜面，主動脈起始部嚴重，與B組相比斑塊邊緣不清楚，可見斑塊表面不光滑表現(xiàn)，降主動脈病變較B組重。

5 HE染色切片 A組主動脈內(nèi)膜光滑平整，可見排列整齊的內(nèi)皮細胞，內(nèi)膜未見泡沫細胞及脂質(zhì)沉積；B組動脈可見明顯動脈粥樣硬化斑塊，血管內(nèi)膜明顯增厚，內(nèi)皮細胞脫落，管壁內(nèi)見泡沫細胞形成，內(nèi)膜下及斑塊內(nèi)有膽固醇結(jié)晶體形成，部分區(qū)域可見壞死及鈣鹽沉積；C組亦可見明顯粥樣斑塊形成，與B組相比，斑塊較厚但纖維帽較薄、脂核較大，部分斑塊可見纖維帽被溶解征象，管壁內(nèi)可見大量泡沫細胞及炎性細胞，斑塊內(nèi)可見新生血管形成(圖3)。顯微鏡下主動脈弓處斑塊及纖維帽厚度比較，C組斑塊厚度(800.38±98.25) μm明顯大于B組(675.00±109.67) μm(P＜0.05)，但纖維帽厚度(103.50±45.66) μm小于B組(295.83±97.90) μm(P＜0.01)。

討 論

ACS的主要病理機制是不穩(wěn)定的動脈粥樣硬化斑塊破裂及血栓形成，因此發(fā)現(xiàn)影響斑塊進展速度的因素及預測動脈粥樣斑塊的穩(wěn)定性具有十分重要的臨床指導意義。影響穩(wěn)定斑塊進展為易損斑塊的相關(guān)因素主要包括斑塊自身結(jié)構(gòu)即“大脂核”特征薄纖維帽、血管內(nèi)皮功能異常、高膽固醇血癥以及炎癥反應等[2-5]；且發(fā)現(xiàn)血清標記物如MMP-9、IL-18等可以預測易損斑塊[6-7]。眾所周知導致動脈粥樣硬化斑塊的罪魁禍首是高水平的LDL-C，其通過氧化修飾成為ox-LDL，ox-LDL在動脈斑塊的早期形成和后期進展中均發(fā)揮重要生物學效應，包括損傷血管內(nèi)皮細胞、表達黏附分子、聚集白細胞以及形成泡沫細胞，其增加可導致粥樣斑塊由穩(wěn)定向不穩(wěn)定的易損斑塊轉(zhuǎn)化[8]。然而臨床工作中，部分ACS患者發(fā)病時卻表現(xiàn)出較低水平的LDL-C，由此推測血脂平穩(wěn)度在斑塊的進展中可能起到一定的作用。

本研究結(jié)果顯示：血脂波動組TC、LDL-C的SI值分別為3.60、3.29，明顯低于對照組的12.51、7.61。飼養(yǎng)12周后，與空白組及基礎(chǔ)值相比，對照組和血脂波動組血清TC、TG、LDL-C及hs-CRP水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義；24周后，與對照組相比，血脂波動組hs-CRP水平明顯升高。血脂波動組不同周數(shù)腹主動脈超聲示血管內(nèi)中膜厚度明顯高于對照組，超聲下24周與12周斑塊大小比較可見血脂波動組進展速度較對照組快。主動脈形態(tài)學變化方面，對照組及血脂波動組主動脈內(nèi)壁肉眼及光鏡下均可見典型動脈粥樣斑塊，血脂波動組斑塊面積百分比較對照組升高，但斑塊纖維帽厚度較對照組薄(肩部明顯)。另外，血脂波動組斑塊纖維帽周圍有大量炎性細胞浸潤，部分區(qū)域可見新生血管及明顯纖維帽不連續(xù)現(xiàn)象。本研究結(jié)果證實，血脂平穩(wěn)度對動脈粥樣硬化斑塊的進展速度有所影響，且SI越小即血脂波動越大，斑塊的發(fā)展速度越快。原因可能為炎癥反應貫穿動脈粥樣硬化斑塊發(fā)生和進展的全過程，既往亦有文獻證實hs-CRP與動脈粥樣硬化斑塊進展明顯相關(guān)[9-11]。而本研究中血脂波動組hs-CRP水平較高，且切片中可見大量炎性細胞浸潤，可推測不平穩(wěn)的血脂水平造成斑塊內(nèi)炎癥反應增加，而加劇的炎癥反應導致動脈斑塊進展速度加快。但是血脂水平波動究竟是通過何種機制導致血管內(nèi)炎癥反應增加，仍需進一步研究。

1 Juhel C， Pafumi Y， Senft M， et al. Chronically gorging v. nibbling fat and cholesterol increases postprandial lipaemia and atheroma deposition in the New Zealand white rabbit［J］. Br J Nutr， 2000，83（5）：549-559.

2 Rai S， Hare DL， Zulli A. A physiologically relevant atherogenic diet causes severe endothelial dysfunction within 4 weeks in rabbit［J］.Int J Exp Pathol， 2009， 90（6）： 598-604.

3 Virmani R， Burke AP， Farb A， et al. Pathology of the vulnerable plaque［J］. J Am Coll Cardiol， 2006， 47（8 Suppl）： C13-C18.

4 Alekperov éZ， Nadzhafov RN. Contemporary concepts of the role of inflammation in atherosclerosis［J］. Kardiologiia， 2010， 50（6）： 88-91.

5 Funk SD， Orr AW. Ephs and ephrins resurface in inflammation， immunity， and atherosclerosis［J］. Pharmacol Res， 2013 67（1）：42-52.

6 Cimmino G， Ragni M， Cirillo P， et al. C-reactive protein induces expression of matrix metalloproteinase-9： A possible link between inflammation and plaque rupture［J］. Int J Cardiol， 2012.［Epub ahead of print］

7 Blankenberg S， Luc G， Ducimetière P， et al. Interleukin-18 and the risk of coronary heart disease in European men： the Prospective Epidemiological Study of Myocardial Infarction （PRIME）［J］.Circulation， 2003， 108（20）： 2453-2459.

8 Hayashida K， Kume N， Minami M， et al. Lectin-like oxidized LDL receptor-1 （LOX-1） supports adhesion of mononuclear leukocytes and a monocyte-like cell line THP-1 cells under static and flow conditions［J］. FEBS Lett， 2002， 511（1-3）： 133-138.

9 金智敏，趙曉薇，沈國英，等．超敏C反應蛋白與老年高血壓患者合并頸動脈斑塊穩(wěn)定性的關(guān)系及其性別差異［J］.中華老年多器官疾病雜志，2010，9（4）：342-345．

10 趙紅敏，王銘維，王彥永．CRP與動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的研究進展［J］.臨床合理用藥雜志，2012，5（20）：165-166．

11 Silva D， Pais de Lacerda A. High-sensitivity C-reactive protein as a biomarker of risk in coronary artery disease［J］. Rev Port Cardiol，2012， 31（11）：733-745.