青海部分地區(qū)藏獒細(xì)小病毒感染的流行病學(xué)調(diào)查

張紅見(jiàn)，鐵忠華，趙 靜，鐘耀安，沈得貴

（1. 青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海西寧 810016；2. 青海畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，青海湟源 812100；3. 青海省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，青海西寧 810001）

犬細(xì)小病毒感染（Canine Parvovirus Infection，CPI）是由犬細(xì)小病毒（Canine Parvovirus，CPV）引起犬的一種以劇烈嘔吐、出血性腸炎、血性水樣便、脫水、白細(xì)胞顯著減少和心肌炎為特征的急性傳染病，幼齡犬多發(fā)[1]，且純種犬發(fā)病率比雜種犬、土種犬高。CPV首先由美國(guó)學(xué)者Eugster和Nairn于20世紀(jì)70年代從患出血性腸炎的犬糞便中分離獲得[2]。1982 年梁士哲在我國(guó)首次分離到該病毒，隨后各地均有大量報(bào)道[3-4]。作為當(dāng)今世界大型犬原始祖先的藏獒是當(dāng)今犬類中唯一沒(méi)有被時(shí)間和環(huán)境因素所改變的活化石，其基因庫(kù)中匯聚了世界犬種最優(yōu)良的性狀和性能基因，屬國(guó)家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物[5]。根據(jù)青海省農(nóng)牧業(yè)綜合區(qū)劃所1995年的調(diào)查統(tǒng)計(jì)，全省有藏獒9萬(wàn)多只，而純種藏獒僅為600多只，且其種群品質(zhì)退化極為嚴(yán)重，處于瀕臨滅絕的地步。隨著國(guó)內(nèi)外藏獒協(xié)會(huì)影響力的逐年增大，特別是自2007年以來(lái)藏獒熱的持續(xù)升溫，純種藏獒已被賣(mài)到千萬(wàn)天價(jià)。而內(nèi)地藏獒數(shù)量的銳減、品種劣化以及各種疫病的侵襲，許多藏獒販賣(mài)者又把目標(biāo)轉(zhuǎn)向青海省的玉樹(shù)、果洛等地。加之2010年玉樹(shù)地震中許多藏獒因地震死亡或變成流浪獒被撲殺，使這里的藏獒資源遭到滅頂之災(zāi)。為了初步摸清CPV在青藏高原部分地區(qū)藏獒中的流行現(xiàn)狀，為以后有效防控藏獒CPV積淀流行病學(xué)資料和保護(hù)其種群繁衍提供理論依據(jù)，進(jìn)一步為探索青藏高原的奧秘，探尋生存于世界屋脊的動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境的方式與能力，為全面開(kāi)展對(duì)青藏高原生物多樣性保護(hù)奠定研究基礎(chǔ)。2011年10月至2012年5月，選擇較為快速的CPV-ELISA診斷試劑盒和CPV檢測(cè)試紙條對(duì)青海省部分地區(qū)藏獒血清與糞便樣品進(jìn)行了血清學(xué)與病原檢測(cè)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 待檢血清和糞便來(lái)源 隨機(jī)選取青海省河南縣、祁連縣、西寧市加旺寵物醫(yī)院和陶北村獒園的藏獒進(jìn)行前肢靜脈采血，帶回實(shí)驗(yàn)室后常規(guī)方法分離血清，置-20℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。同時(shí)用滅菌棉拭子在藏獒直腸深部采取糞便，應(yīng)用犬細(xì)小病毒檢測(cè)試紙條進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)CPV的檢測(cè)。

1.1.2 ELISA檢測(cè)試劑盒與犬細(xì)小病毒檢測(cè)試紙條 犬細(xì)小病毒診斷試劑盒（ELISA），購(gòu)自上海研招生物技術(shù)有限公司（生產(chǎn)批號(hào)：20120525）。犬細(xì)小病毒檢測(cè)試紙條，購(gòu)自上海快靈生物科技有限公司（生產(chǎn)批號(hào)：110506）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)小病毒（CPV）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）每管加入滅菌生理鹽水2mL，在MM-1型微型振蕩器上振蕩，每支試管振蕩15min/次，連續(xù)3次。

1.2.1.1 加樣 分別在陰、陽(yáng)性對(duì)照孔中加入陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照各50μL，然后依次在待測(cè)樣品孔中加入樣品稀釋液各40μL，最后再分別加入待測(cè)血清各10μL。加樣時(shí)將樣品加入酶標(biāo)板的孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。

1.2.1.2 溫育 用封板膜封板，置37℃溫箱溫育30min。

1.2.1.3 配液 將30（48T的20倍）倍濃縮的洗滌液加入蒸餾水配制600mL后備用。

1.2.1.4 洗滌 小心揭開(kāi)封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

1.2.1.5 加酶 每孔各加入酶標(biāo)試劑50μL，空白孔除外。溫育（操作同1.2.1.2），洗滌（操作同1.2.1.4）。

1.2.1.6 顯色 每孔依次加入顯色劑A 和顯色劑B各50μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15min。

1.2.1.7 終止 每孔各加入終止液50μL，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立即變成黃色）。

1.2.1.8 測(cè)定 將空白孔調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各吸收孔的吸光度（OD值）。測(cè)定應(yīng)在加入終止液后的15min之內(nèi)進(jìn)行。

1.2.2 犬細(xì)小病毒試紙條檢測(cè)

1.2.2.1 用滅菌的棉拭子收集藏獒糞便，然后將棉拭子插入含有1mL樣品處理液的樣品管中，攪動(dòng)均勻并靜置10min，待糞便沉淀于底部后再取樣品上清液進(jìn)行CPV的檢測(cè)。

1.2.2.2 在犬細(xì)小病毒試紙條的加樣孔中加入2滴經(jīng)上述處理的糞便樣品，5min后觀察結(jié)果。

1.2.3 結(jié)果判定

1.2.3.1 犬細(xì)小病毒（CPV）酶聯(lián)免疫分析（ELISA） 陽(yáng)性對(duì)照孔平均值≥1.00、陰性對(duì)照孔平均值≤0.10時(shí)判定試驗(yàn)有效。臨界值（CUT OFF） =陰性對(duì)照孔平均值+0.15。樣品OD值＜臨界值（CUT OFF）者為犬細(xì)小病毒（CPV）抗體陰性，樣品OD值≥臨界值（CUT OFF）者為犬細(xì)小病毒（CPV）抗體陽(yáng)性。

1.2.3.2 犬細(xì)小病毒（CPV）試紙條檢測(cè) 只有一條線（質(zhì)控“C”線）出現(xiàn)判定為陰性，出現(xiàn)兩條線（“C”和“T”線）判定為陽(yáng)性，無(wú)質(zhì)控線出現(xiàn)判定為無(wú)效。

2 結(jié)果

2.1 犬細(xì)小病毒（CPV）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）

應(yīng)用CPV ELISA試劑盒對(duì)青海部分地區(qū)的60份藏獒血清進(jìn)行ELISA檢測(cè)，共檢出陽(yáng)性糞便6份，陽(yáng)性率為10.00%（6/60），與CPV試紙條檢測(cè)的陽(yáng)性符合率為83.33%。在ELISA酶標(biāo)板上的A1和A2號(hào)為樣性對(duì)照孔；A5和A6號(hào)為陰性對(duì)照孔；A9為空白孔。下劃線數(shù)字表示60份待檢血清樣品中CPV陽(yáng)性血清的對(duì)應(yīng)OD值。經(jīng)測(cè)定，臨界值（CUT OFF）=0.056+0.15=0.206；陽(yáng)性對(duì)照孔平均值=2.581；陰性對(duì)照孔平均值=0.056。詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表1、表2。

表1 青海省部分地區(qū)犬細(xì)小病毒的ELISA檢測(cè)

表2 ELISA和試紙條檢犬細(xì)小病毒測(cè)陽(yáng)性數(shù)統(tǒng)計(jì)

2.2 CPV試紙條檢測(cè)

應(yīng)用CPV檢測(cè)試紙條對(duì)青海部分地區(qū)的60份藏獒糞便進(jìn)行檢測(cè)，共檢出陽(yáng)性糞便5份，陽(yáng)性率8.33%（5/60），詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表1、表2。

3 討論與小結(jié)

3.1 CPV作為細(xì)小病毒屬中的主要成員，對(duì)犬科動(dòng)物具有較強(qiáng)致病作用，其抗原性隨時(shí)間的遷移而不斷發(fā)生變化，導(dǎo)致諸如CPV-2a、CPV-2b、CPV-2e（a）及CPV-2C（b）亞型[6]的突變株不斷產(chǎn)生，CPV感染的宿主譜也在不斷地?cái)U(kuò)大，并在世界范圍內(nèi)廣泛傳播流行。各個(gè)國(guó)家的流行情況存在較大的差異：在意大利以CPV-2c感染為主[7-8]；烏拉圭以CPV-2c為主[9]；印度主要流行株為CPV-2a和CPV-2c；越南以CPV-2b和CPV-2c感染為主[10-11]；美國(guó)以CPV-2b和CPV-2c感染為主[12]。蘇建青等報(bào)道，1982—1996年我國(guó)以CPV-2a為主，1997年后逐漸以CPV-2b為主。此外，張國(guó)倉(cāng)對(duì)內(nèi)蒙古大通縣境內(nèi)犬類疫病進(jìn)行的流行病學(xué)調(diào)查顯示，因傳染病死亡的犬只占被調(diào)查犬的10.02%，其中因CPV感染死亡的占6.01%。2004—2009年期間蘭州市CPV陽(yáng)性檢出率高達(dá)25.88%，其中2004—2008年間陽(yáng)性檢出率呈逐漸下降趨勢(shì)，但2009年又略有上升[13]。2010年吉林市對(duì)就診的4372例疑似CPI病犬的發(fā)病情況的調(diào)查顯示其陽(yáng)性率高達(dá)74.33%[14]。2009 年在南京動(dòng)物醫(yī)院就診的11342 例病例中，CPI占 33.25%[15]。但國(guó)內(nèi)外針對(duì)藏獒CPV的報(bào)道相對(duì)較少，為了初步摸清CPV在青海省部分地區(qū)藏獒中的流行現(xiàn)狀，為以后有效防控藏獒CPI積累流行病學(xué)資料和保護(hù)其種群繁衍提供理論依據(jù)，本研究選用CPV ELISA試劑盒和CPV檢測(cè)試紙對(duì)青海省河南縣、祁連縣、西寧市陶北村獒園及嘉旺寵物醫(yī)院采集的樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示陽(yáng)性檢出率分別為10.00%（6/60）和8.33%（5/60），由X2= 0.1000，P>0.05，表明以上兩種方法差異不顯著，兩種方法的陽(yáng)性符合率為83.33%（5/60）。揭示青海部分地區(qū)的藏獒可攜帶CPV或發(fā)生CPI，而此次CPV的檢出率遠(yuǎn)低于蘭州、吉林、南京等地的檢出率，這可能與長(zhǎng)期適應(yīng)高原惡劣自然環(huán)境的藏獒抵抗力比其他犬類較強(qiáng)有關(guān)。

3.2 目前，針對(duì)CPV的檢測(cè)方法種類較多，主要有常規(guī)病毒分離（VI）、電鏡檢查（EM）、血凝/血凝抑制試驗(yàn)（HA/HI）、乳膠凝集試驗(yàn)（LAT）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ ELISA）、免疫層析試驗(yàn)（ICA）、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）及實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time PCR）等。但這些方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)，VI和LAT等方法敏感性和特異性較低。HA /HI雖有較高的特異性，但敏感性較低，而且試驗(yàn)需要新鮮健康的紅細(xì)胞。EM 、PCR和ICA雖說(shuō)較其它方法特異性和敏感性強(qiáng)，但需要較精密的儀器設(shè)備和較繁瑣的的步驟，不適于基層的推廣。ELISA的靈敏性很高，甚至高于PCR 的靈敏性，結(jié)果的準(zhǔn)確性很高，適用于基層的大批量樣品的檢測(cè)，但對(duì)沒(méi)有血凝活性的CPV變異株[16]，易造成檢驗(yàn)結(jié)果的不準(zhǔn)確性。由于CPV 抗原檢測(cè)試紙條也存在假陽(yáng)性及假陰性現(xiàn)象，在臨床應(yīng)用過(guò)程中極易受到操作者的影響，且不同生產(chǎn)廠家的試紙條敏感度和特異性也會(huì)有差異[17]，但它具有HA /HI和PCR所不具有的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，即操作簡(jiǎn)便、出示結(jié)果快速。為此，本研究選擇CPV ELISA診斷試劑盒和CPV檢測(cè)試紙相結(jié)合的方法，分別對(duì)青海省部分地區(qū)藏獒血清樣品中的CPV抗體和藏獒糞便中的CPV進(jìn)行檢測(cè)，以期為藏獒CPV感染的流行病學(xué)診斷提供理論依據(jù)。

3.3 據(jù)調(diào)查，當(dāng)前侵害藏獒的主要病毒是CPV和犬瘟熱病毒，其中CPV感染是主要影響6 周齡至6月齡藏獒存活率的原因[18]。加之西寧市是全國(guó)最大的藏獒集散地，每年約有5000只藏獒被輸出到國(guó)內(nèi)外，藏獒的流動(dòng)性特別強(qiáng)，這也就加大了藏獒感染CPV的機(jī)率，使得在實(shí)際工作中防控藏獒CPI的難度也隨之加大。為了有效預(yù)防藏獒CPI的發(fā)生，其首要任務(wù)就是組織培訓(xùn)養(yǎng)殖戶的防病意識(shí)；其次對(duì)引種的獒犬和新生幼犬加強(qiáng)免疫抗體水平檢測(cè)工作，幼齡獒斷奶后應(yīng)及時(shí)應(yīng)用CPV滅活苗和犬五聯(lián)弱毒疫苗進(jìn)行免疫。在常規(guī)免疫之后，再增加1～2次，間隔15～21 d，以增強(qiáng)免疫效果。在治療CPI的早期，應(yīng)對(duì)病獒禁食，使用CPV高免血清、單克隆抗體或用免疫球蛋白進(jìn)行治療，或灌服生理鹽水以維持機(jī)體內(nèi)電解質(zhì)平衡。除了采取綜合治療措施外，良好的護(hù)理和科學(xué)的飼養(yǎng)管理極為重要，對(duì)病獒應(yīng)注意防寒保暖，飼喂易消化的食物和助消化的藥物以促進(jìn)病犬消化機(jī)能的恢復(fù)。

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