增生性瘢痕和正常皮膚組織中TGF-β1及Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)的比較

姜春英 ，劉德明 ，劉德伍 ，彭 燕 ，宋志芳 ，寧 璞

（南昌大學(xué)a.第一附屬醫(yī)院燒傷中心；b.醫(yī)學(xué)院解剖教研室，南昌 330006）

增生性瘢痕系由各種創(chuàng)傷后成纖維細(xì)胞過度增殖、細(xì)胞外基質(zhì)無序沉積所致，多發(fā)于深及真皮的創(chuàng)傷。轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）作為體內(nèi)重要的具有多功能生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，在創(chuàng)傷修復(fù)、臟器纖維化、炎癥性疾病、自身免疫性疾病和腫瘤中都具有重要意義[1]。TGF-β1 是最重要的促瘢痕形成因子[2]。 有研究[3]表明，瘢痕纖維化的主要病理學(xué)改變是細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分是Ⅰ型膠原，也含有Ⅲ型膠原。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)法觀察人增生性瘢痕組織和正常皮膚組織中TGF-β1和Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達(dá)的變化，探討其在增生性瘢痕的形成和演化過程中的意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要儀器及試劑

全自動(dòng)脫水機(jī)（德國Leica公司）、石蠟包埋機(jī)、輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)、烘片機(jī)、電熱鼓風(fēng)恒溫烤箱、顯微鏡（日本 Olympus公司）。兔抗 TGF-β1（美國 Proteintech公司），Collagen TypeⅠ一抗、Collagen Type Ⅲ一抗（武漢博士德生物工程有限公司），PV9000通用二步法試劑盒、DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.1.2 組織標(biāo)本收集

選擇2012年2月至2013年2月南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院燒傷整形科住院的患者10例，年齡20～30歲，均未接受藥物治療和放射治療，手術(shù)時(shí)間為創(chuàng)面愈合后4～12個(gè)月。經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)、患者本人及家屬知情同意，取其整形手術(shù)切除的增生性瘢痕及其鄰近的正常皮膚組織。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將瘢痕組織和瘢痕邊緣正常皮膚組織修除表皮和皮下組織，分別置于10%甲醛中固定12 h，石蠟包埋，經(jīng)常規(guī)組織切片脫蠟至水后，分別采用兔多克隆抗體 Collagen TypeⅠ、Collagen TypeⅢ、TGF-β1一抗，采用免疫組織化學(xué)SP法進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)操作均按試劑盒說明書進(jìn)行，其具體步驟如下：1）石蠟切片，厚度均取 3 μm，65 ℃烤片 30 min；2）常規(guī)脫蠟至水，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ 各5 min，無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇各浸泡3 min，PBS沖洗；3）抗原熱修復(fù)（檸檬酸緩沖液加熱至98℃）5 min，每5～10 min修復(fù)1次，讓其自然冷卻；4）3%H2O237℃ 去離子水孵育 5 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS洗 3×5 min；5）置于0.01 mol·L-1、pH 6.0的枸櫞酸鹽緩沖液中行抗原熱修復(fù) 15 min，PBS 洗 3×5 min；6）滴加 Collagen TypeⅠ、Collagen TypeⅢ、Smad2、TGF-β1 一抗，4 ℃過夜，PBS洗 3×5 min；以PBS代替一抗作為陰性對照；7）滴加通用型IgG抗體-HRP多聚體，室溫孵育15 min，PBS 洗 3×5 min；8）DAB 顯色 5～10 min，PBS 洗 3×5 min；9）蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化；10）吹干后中性樹脂封片；11）通過光學(xué)顯微鏡觀察免疫組織化學(xué)結(jié)果，以細(xì)胞呈棕黃色染色為陽性表達(dá)。

2 結(jié)果

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：在增生性瘢痕組織中，TGF-β1在表皮細(xì)胞、真皮層中成纖維細(xì)胞及部分炎癥細(xì)胞等胞漿中呈棕黃色顆粒表達(dá)（封四圖1）；正常皮膚組織中 TGF-β1低表達(dá)（封四圖 2）。在增生性瘢痕組織中，Ⅰ型膠原染色呈棕黃色顆粒，細(xì)胞外基質(zhì)顯示出棕黃色纖維（封四圖3）；在正常皮膚組織中Ⅰ型膠原呈低表達(dá)（封四圖4）。Ⅲ型膠原染色呈棕黃色顆粒，細(xì)胞外基質(zhì)顯示出棕黃色纖維（封四圖5）；正常皮膚組織中Ⅲ型膠原呈低表達(dá)（封四圖6）。人增生性瘢痕組織中 TGF-β1，Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達(dá)均顯著高于正常皮膚組織。

3 討論

盡管治療增生性瘢痕的方法有很多種，但其療效難以讓人滿意[4]。近幾年，國內(nèi)外關(guān)于探究增生性瘢痕形成的內(nèi)在機(jī)制的研究層出不窮[5]。目前認(rèn)為，增生性瘢痕的發(fā)生機(jī)制主要為皮膚組織成纖維細(xì)胞的過度增生和活化，而成纖維細(xì)胞的過度增生活化打破了膠原合成和基質(zhì)降解之間的平衡，導(dǎo)致了纖維蛋白、黏多糖及皮膚膠原的過度沉積。提示，增生性瘢痕的防治應(yīng)從源頭上避免或減輕異常瘢痕的發(fā)生、發(fā)展。

TGF-β1及Ⅰ、Ⅲ型膠原作為調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、發(fā)育及分化的重要分子，可能在增生性瘢痕的形成中發(fā)揮了重要的作用[6]。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)SP法檢測增生性瘢痕與正常皮膚組織中TGF-β1及Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達(dá)，結(jié)果顯示：TGF-β1及Ⅰ、Ⅲ型膠原在增生性瘢痕組織中含量明顯高于正常皮膚組織。提示，其在增生性瘢痕形成和演化過程中可能發(fā)揮靶點(diǎn)效應(yīng)。如能針對TGF-β1及Ⅰ、Ⅲ型膠原進(jìn)行干預(yù)和調(diào)控，有望在增生性瘢痕的防治中發(fā)揮積極的作用。

[1] 高春芳.TGFβ1基因變異與疾病相關(guān)性研究展望[J].世界華人消化雜志,2007,15（28）:2959-2965.

[2] Abe M,Yokoyama Y,Ishikawa O.A possible mechanism of basic fibroblast growth factor-promoted scarless wound healing:the induction of myofibroblast apoptosis[J].Eur J Dermatol,2012,22（1）:46-53.

[3] Massague J.How cells read TGF-beta signals[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2000,1（3）:169-178.

[4] Reish R G,Eriksson E.Scar treatments：preclinical and clinical studies[J].J Am Coll Surg,2008,206（4）:719-730.

[5] 杜飛亞,談偉強(qiáng).瘢痕的形成機(jī)制及治療研究進(jìn)展[J].全科醫(yī)學(xué)臨床與教育,2010,8（5）:528-530.

[6] Gressner A M,Weiskirchen R.Modern pathogenetic concepts of liver fibrosis suggest stellate cells and TGF-beta as major players and therapeutic targets[J].J Cell Mol Med,2006,10（1）:76-99.